牛副流感病毒的合成基因的制備方法技術

發明專利技術公開了構成一種用于產生病毒蛋白或其一部分的合成基因方法．該方法可用于負鏈ＲＮＡ病毒基因組上組建基因，如流感病毒或副流感病毒基因于適當宿主上，用表達合成基因所制備的蛋白或其一部分，并用于疫苗或診斷目的．（*該技術在2005年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
本專利技術是有關生產抗牛Ⅲ類付流感病毒(PI-3)疫苗，這種病毒分類是付粘病毒，尤其是編碼的PI-3蛋白的合成DNA基因可以以在此公開了的方法生產出來。這些基因可透過轉錄細胞來生產所選擇的病毒蛋白，可應用于疫苗，診斷動物或其他的生物蛋白。合成基因本身將用作為一種診斷劑。牛Ⅲ號付流感病毒也稱之為PI-3或載熱病毒，是在牛的急性呼吸道病癥的綜合癥開始出現時的主要因素在病理上和經濟上是有相當影響。載熱綜合病癥在PI-3病毒染下開始出現，通常在家畜運輸或牧菌所引起的感染。例如巴斯德氏multocida莫類或巴斯德氏溶血菌類結果是產生載熱綜合癥。由于體重減輕、昂貴治療和延遲了供應市場所帶來的每年經濟損失估計在七千五百萬美元。一種類似的病 毒所感染給羊，出現一種類似于載熱綜合癥呼吸系統疾病。病毒疫苗包括活的減毒疫苗已成功使用了大約20年，例如由巴斯德氏multocida菌和巴德氏haemolytico菌中經化學變異菌種而獲得的活的細菌疫苗已在美國4923545文件中(庫塞拉)公開。予防付流感病毒的疫苗研究已是受到現行疫苗有限效力所限制，部份是由于來自存在的抗體或其它病毒疫苗抑制的影響。另外，采用活的病毒疫苗于繁殖動物上可能會對胎兒有影響并常造成流產。最近在配制一種信息RNA(m RNA)分的雙鏈DNA雙分子復本時已有可能生產一種合成基因。按這種方法生產的合成基因將編碼成所選擇的信息核糖核酸轉錄產物蛋白。這個基因工程工藝的一個實例已所選擇的信息核糖核酸轉錄產物蛋白。這個基因工程工藝的一個實例已公開在美國專利4，357，421中，其中它被用來生產流感血細胞凝集素蛋白的合成基因。流感病毒不包括脫氧核糖核酸而含有一種分段逆枝的病毒的核糖核酸(VRNA)基因組，它們在感染時產生病毒信息核糖核酸m RNA和產生出另外病毒核糖核酸(v RNA)模板。流感病毒基因組具有可分的類別，也就是每個基因是以一種病毒核糖核酸后分離片卉形式出現，它們分別轉錄產生信息核糖核酸。這個工藝由Emtage及其它人公開，分離的病毒核糖核酸作為一種模板。應用在有意義的合成基因上。現在有可能構成一種合成或脫氧核糖核酸的(DNA)碎片，它相應于一種病毒基因，這基因位于PI-3病毒不可分的反鏈(負鏈)病毒核糖核酸基因組上。得到了用病毒感染的細胞而信息核糖核酸-病毒和宿主RNA兩者會被其它的細胞組分離。互補在原來的信息核糖核酸上的雙鏈合成的脫氧核糖核酸分子由此形成。這種互補的脫氧核糖核酸(CDNA)群，無性繁殖成反向轉錄的脫氧核糖核酸基因庫，由此基因庫可以選擇病毒的特殊基因。有意義的病毒基因例如在互逆雜交和雜化物選擇轉錄作用條件，被確定并被分離出來。一旦有重大意義病毒基因被確定，它被嵌入在一個合適的載體，這個載體用來轉錄一合適表示基因的宿主，這種被表示蛋白可以作為配制疫苗，診斷劑和其它的亞單位。該專利技術目的是提供一方法，由此可以構成一種與一般在牛付流感Ⅲ類病毒，一種付粘病毒，基因組上所發現的基因相應的合成基因。與此目的密切相關的是確定及分離這種合成基因，其編碼為一特殊毒靶蛋白，例如一種象血細胞凝集毒抗原蛋白。專利技術另一目的是為經濟地生產用合成基因編碼的病毒靶蛋白，以在轉錄宿主中表達所擇的合成基因。專利技術還有一目的是提供一種生產脫氧核糖核酸系列一種方法，從而可以確定蛋白氨基酸系列，以構成合成肽。另外，打算使用該專利技術工藝生產有特征的脫氧核糖核酸探測物及肽特征劑。下述縮略語在敘述個專利技術過程中會用到bp 堿基對BSA 牛類免疫血漿清蛋白CDNA 反向轉錄的脫氧核糖核酸ci 居里cm 厘米d ATP 脫氧腺苷三磷酸d CTP 脫氧胞苷三磷酸d GTP 脫氧鳥苷三磷酸d TTP 脫氧胸苷三磷酸DTT 二硫蘇糖醇DNA 脫氧核糖核酸EDTA 乙二胺四乙酸GUSCN 硫代氰酸胍HA 血細胞凝集素HEPER N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸IU 國際單位M 克分子MDBK 馬丁-達爾比牛腎細胞MET 蛋氨酸m M 毫克分子m RNA 信息核糖核酸NC 殼包核酸蛋白oligo(d A) 由少量(通常2-20)脫氧腺苷分子組成聚合物oligo(DT) 由少量(通常2-20)脫氧胸苷分子組成的聚合物32P 放射磷質量數32% 百分比PI-3 牛Ⅲ類付流感病毒pipes 哌嗪乙烷硫酸poly-A 聚脫氧腺苷poly-c 聚脫氧脫苷poly-g 聚脫氧鳥苷RNA 核糖核酸r RNA 核蛋白核糖核酸SDS 十二烷基硫酸鈉(去垢劑)SSC 0.15克分子氯化鈉-0.015檸檬酸鈉TNE 10毫克分子三鹽酸(酸堿度8.0)100毫克分子氯化鈉，1.毫克分子依地酸(酸堿度8.0)Tris-ECI 三鹽酸t RNA 轉移核糖核酸U 單位v/v 體積/體積VRNA 病毒核糖核匹2w/v 重量/體積x 氨基酸殘留物附圖簡單說明圖1四頁篇幅說明用該專利技術方法無性繁殖的牛類付流感病毒血凝素CDNA的DNA系列，包括限制酶分裂圖。圖2是把圖1無性繁殖的CDNA限制醢列成表。圖3把1 HA CDNA基因的DNA系列轉錄成相應的氨基酸系列。圖4將圖1的HA CDNA基因轉錄產物HA蛋白概推斷氨基酸系列。在敘述本專利技術時，涉及“m RNA”和“CDNA”，都意味著涉及整個的核糖核酸或脫氧核糖核酸分子或是分別涉及它們任何生物學意義部分，也就是說，意圖是使這個專利技術方法即就一個完整的病毒的信息核糖核酸而言，又就這病毒的信息核糖酸分子分支部分而言付諸實施。例如，可要求編碼實際的蛋白亞單位或其一部分或編碼成實際上的抗原部位的病毒基因部份分離，編碼及構成細胞。PI-3病毒按組織學，血清學，生物化學性質分類是一種付粘病毒。付粘病毒是“核糖核酸病毒”并且不含有脫氧核糖核酸。它們的遺傳學信息只僅僅包含在一單枝，連續(或未被分割的)一塊核糖核酸內。基于核糖核酸基因組反向技，付粘病毒族成員表現出一種重現戰略。付粘病毒核糖核酸重現必然伴有在與病毒同時出現的轉錄酶絡合物上，由單一的觸媒劑產生的反支模型的分支基因組的信息核糖核酸物質。在這些已研究過的系統中，每個信息核糖核酸都與多核糖核蛋白同時發生聚腺苷反應并通常編碼成單一的病毒蛋白。雖然幾種病毒結構蛋白已經確定下來了，但已很少再去研究PI-3型再現了。例如，Shibuta和其它的人的“牛類付流感三型病毒的特征”“微生物免疫學”第23卷617-628頁(1979)和Guskey等人的“人付流感Ⅲ型病毒高的增長率和提純及病毒結構蛋白的初始分析”。J.Gen“病毒生物學”54卷115頁-123頁(1981)。現有技術還未揭示有關細胞內的蛋白或病毒信息核糖核酸物質的情況。另外，除了在此公開外轉錄和編碼測定PI-3信息核糖核酸還沒有開始。在此所公開的專利技術，使人們能做成一種單個的合成基因或做成相應于處在未被分割的負枝的PI-3病毒的核糖核酸的一個本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一個合成基因或ＤＮＡ碎片特征在于：ａ）偏碼牛Ⅲ類付流感病毒蛋白或其部分，及ｂ）包括一雙鏈ＤＮＡ基因，該基因是病毒ＲＮＡ基因編碼在上述蛋白或其部分的一個復本。

【技術特征摘要】
1.一個合成基因或DNA碎片特征在于a)偏碼牛Ⅲ類付流感病毒蛋白或其部分，及b)包括一雙鏈DNA基因，該基因是病毒RNA基因編碼在上述蛋白或其部分的一個復本。2.權項1合成基因，其編碼牛Ⅲ類付流感病毒血細胞凝集素或其一部分。3.權項2合成基因的DNA系列，該系列開始具有一起始密碼子，結束具有終端或停止密碼子，并且該DNA系列包括圖1所示的核苷酸系列或該系列部分。4.權項2合成基因的DNA系列，該系列編碼一個具有圖4示氨基酸系列一多肽或其一部分。5.權項1合成基因，其編碼牛的Ⅲ類付流感結構融合蛋白或其的一部分。6.權項1雙鏈DNA基因包括在一載體或質粒中。7.權項6的載體或質粒，在它們之中上述的DNA基因編碼牛的Ⅲ類付流感血細胞凝集素，或其的一部分。8.權項6的載體或質粒，在它們之中上述的DNA基因編碼牛的Ⅲ類付流感結構融合蛋白或其一部分。9.權項1的雙鏈DNA基因包括在一宿主細胞中。10.權項9的宿主細胞，其中上述DNA基因編碼牛的Ⅲ類付流感血細胞凝集素或其一部份。11.權項9宿主細胞，其中上述DNA基因編碼牛的Ⅲ類付流感結構融合蛋白或其一部份。12.培養權項9上述的宿主細胞產生出合成的牛Ⅲ類付流感病毒蛋白或其一部分。13.權項12的蛋白或其一部份，其包括圖4示氨基酸系列或其一部分。14.構成一種對于病毒載體蛋白的合成基因的方法，病毒載體蛋白被編碼在位于未被分割的牛的類付流感病毒負鏈病基因組的基因的予期位置上。該方法包括有a)分離大量具有編碼上述病毒蛋白基因的m RNA。b)用酶逆轉錄和低脫氧核苷酸初始分子由上述大量的m RNA構成雙鏈的m RNA/c DNA雜化物。c)溶解或去掉上述雜化物的m RNA鏈。d)在步驟(c)之后由所保留下來的單鏈CDNA，用DNA多聚酶產生出基本上完整的雙鏈CDNA分子，并e)使用單鏈特殊核酸酶修整上述基本完整的雙鏈CDNA分子的單鏈端部位置。15.權項14方法，用其中上述合成基因插放到適宜的載體上，適合的宿主與重組載體一起被轉錄，并轉錄宿主克隆到所生成的包含上述病毒載體蛋白合成基因的庫。16.權項14方法，其中在步驟(a)分離的大量m RNA經離心進一步分離多腺苷酸的m RNA。17.權項16方法，其中上述步驟(b)的少量的脫氧核苷酸聚合物分子是將雜化到聚腺苷酸的m RNA的diqo(dt)分子。18.權項14方法，其中，步驟(c)包含用堿基或核糖核酸溶解的m RNA鏈。19.權是項14方法，在此方法中步驟c包含用熱變性作用由CDNA鏈分m RNA鏈。20.權項14方法，在此方法中，合成基因至少編碼在上述病毒載體蛋白一個抗原部位上。21.權項14方法，在此方法中，上述病毒載體胥白是牛Ⅲ類付流感病毒的血細胞凝集素。22.權項21方法，此方...

【專利技術屬性】
技術研發人員：約翰M賴斯，
申請(專利權)人：WR格雷斯公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]