【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及分子生理育種領(lǐng)域，尤其是一種通過(guò)基因工程、常規(guī)育種和生理鑒定有機(jī)結(jié)合，培育一種。
技術(shù)介紹
水稻品種矮稈化和秈型雜交稻的三系配套是現(xiàn)代水稻育種史上的兩個(gè)重要里程碑，它們使水稻產(chǎn)量大幅度的提高。我國(guó)水稻平均產(chǎn)量已達(dá)到6t/hm2，江蘇已超過(guò)8t/hm2，葉面積指數(shù)均達(dá)8～10左右，再通過(guò)增加群體葉面積提高產(chǎn)量已相當(dāng)困難。分析現(xiàn)有高產(chǎn)水稻品種的光能利用率在1～1.5％，而理想的光能利用率可達(dá)3～5％，可見(jiàn)，提高水稻光合效率可能是今后提高水稻產(chǎn)量的有效途徑之一。 眾所周知，植物的多數(shù)性狀，尤其是農(nóng)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)性狀，受多基因控制。要改良這些數(shù)量性狀，僅靠改變其中的某個(gè)基因是很難奏效的，而必須同時(shí)對(duì)控制性狀的多個(gè)編碼基因，甚至調(diào)控基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并使它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植株及其后代中穩(wěn)定地表達(dá)和遺傳才能達(dá)到預(yù)期的目的，這不僅需要大量的研究工作來(lái)證實(shí)，而且聚合多個(gè)基因還會(huì)遇到基因沉默的現(xiàn)象，不僅影響轉(zhuǎn)化的效果，而且還耗資巨大。最近的資料顯示，通過(guò)基因工程將玉米C4光合基因?qū)胨臼且粋€(gè)有效的提高光合效率的途徑。 根據(jù)CO2同化方式的不同，高等植物分為C3，C4和景天酸(CAM)植物，其中，C4植物具有光合效率高、CO2補(bǔ)償點(diǎn)低、幾乎沒(méi)有光呼吸等優(yōu)點(diǎn)，特別在強(qiáng)光、高溫、干旱等條件下，C4植物具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)及水分和營(yíng)養(yǎng)利用率，生物學(xué)產(chǎn)量也較高，作物生理和育種學(xué)家長(zhǎng)期致力于將C4光合特性導(dǎo)入C3作物以提高其光合效率。但科內(nèi)作物C4植物玉米和C3植物水稻的雜種由于染色體不規(guī)則配對(duì)或遺傳障礙而表現(xiàn)不育，因此，通過(guò)常規(guī)育種上難于奏效。近十年來(lái)，C4光合途徑...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種融合高光效和抗早衰性狀的水稻育種方法，其特征在于：ａ）將早衰相關(guān)基因?qū)雰?yōu)質(zhì)的水稻種質(zhì)中，獲得抗早衰的水稻株系；ｂ）將具有Ｃ↓［４］植物ＰＥＰＣ基因穩(wěn)定表達(dá)的水稻種質(zhì)與具有抗早衰特性的水稻株系雜交，獲得Ｆ１雜種； ｃ）對(duì)Ｆ１雜種進(jìn)行高光效和抗早衰特性的生理鑒定，篩選出具有高光效和抗早衰特性的水稻材料；ｄ）將篩選出的具有兩種優(yōu)良生理特性的Ｆ１通過(guò)花粉培養(yǎng)，得到穩(wěn)定的具有兩種優(yōu)良生理特性的花培株系；ｅ）對(duì)穩(wěn)定的花培株系進(jìn)行高光效、抗早衰的 生理鑒定，篩選后獲得融合所述兩個(gè)優(yōu)良生理性狀的水稻純系。
【技術(shù)特征摘要】
1所述的融合高光效和抗早衰性狀的水稻育種方法，其特征在于所述的優(yōu)質(zhì)的水稻種質(zhì)是蘇滬香粳；所述的將早衰相關(guān)基因?qū)雰?yōu)質(zhì)的水稻種質(zhì)中是指通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將玉米的γ-ECS基因轉(zhuǎn)入蘇滬香粳中；所述的將早衰相關(guān)基因?qū)雰?yōu)質(zhì)的水稻種質(zhì)中，獲得抗早衰的水稻株系是指通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將玉米的γ-ECS基因轉(zhuǎn)入蘇滬香粳中獲得抗早衰的水稻株系后，通過(guò)測(cè)定開(kāi)花7天和21天時(shí)劍葉的葉綠素含量和原初光化學(xué)效率，篩選出Fv/Fm衰減不高于10％或葉綠素含量衰減不高于20％的抗早衰材料H1，并使H1代繁衍到H2，獲得攜帶γ-ECS基因的水稻植株。 在本發(fā)明中所述的將具有C4植物PEPC基因穩(wěn)定表達(dá)的水稻種質(zhì)與具有抗早衰特性的水稻株系雜交是指具有C4植物PEPC基因穩(wěn)定表達(dá)的水稻種質(zhì)為父本，以攜帶γ-ECS基因的水稻植株為母本。 在本發(fā)明中所述的進(jìn)行高光效和抗早衰特性的生理鑒定，篩選出具有高光效和抗早衰特性的水稻材料是指通過(guò)測(cè)定C4光合酶活性和葉片光合速率，以及測(cè)定開(kāi)花7天和21天時(shí)劍葉原初光化學(xué)效率(Fv/Fm)和葉綠素含量，篩選出PEPC活性在250～1099μmol/mgChl.h之間，光合速率數(shù)值在16.2～30.8μmol/m2.s之間，同時(shí)Fv/Fm衰減不高于10％或葉綠素含量衰減不高于20％的水稻材料。 在本發(fā)明中所述的將篩選出的具有兩種優(yōu)良生理特性的F1通過(guò)花粉培養(yǎng)，得到穩(wěn)定的具有兩種優(yōu)良生理特性的花培株系是指選取F1單核期的稻穗，放入4℃下處理10天，然后接種于H8的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)出愈傷組織，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MS6中分化成苗，獲得的花培苗種植后，保留二倍體，從而獲得穩(wěn)定的花培株系。 在本發(fā)明中所述的H8培養(yǎng)基的配方為以M8為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D 1mg/L+萘乙酸(NAA)3mg/L+細(xì)胞分裂素(KT)1mg/L+脫落酸(ABA)3mg/L+脯氨酸100mg/L+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖50g/L+瓊脂8g/L；所述的MS6培養(yǎng)基配方為以MS為基本培養(yǎng)基，附加2mg/LKT+1mg/L NAA+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于克服了聚合多個(gè)基因可能帶來(lái)的費(fèi)用和沉默的不足，結(jié)合常規(guī)雜交，生理鑒定和花藥培養(yǎng)的特點(diǎn)，形成一種快速有效植物育種方法。以水稻為例，在中國(guó)現(xiàn)有高產(chǎn)栽培條件下，各種優(yōu)良超級(jí)稻組合不斷涌現(xiàn)的今天，優(yōu)良生理性狀的發(fā)揮程度是關(guān)系到品種的產(chǎn)量的發(fā)揮和推廣范圍的關(guān)鍵因素。但每個(gè)生理性狀的發(fā)揮又是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果，即使通過(guò)分子生物學(xué)和基因工程的現(xiàn)代生物技術(shù)也難以改良，而且將作物中鑒定得到的很多衰老相關(guān)基因(SAGs)或衰老上調(diào)基因(senescence-upregulated genes)，都導(dǎo)入水稻既花費(fèi)巨大，而且多基因聚合還會(huì)出現(xiàn)基因沉默，難以達(dá)到預(yù)計(jì)的結(jié)果，而本方法通過(guò)單一關(guān)鍵基因的表達(dá)和優(yōu)良生理形狀建立對(duì)應(yīng)關(guān)系，將兩個(gè)材料進(jìn)行簡(jiǎn)單的融合，克服了基因多基因?qū)霂?lái)的基因沉默、常規(guī)育種方法的周期長(zhǎng)和植物生態(tài)環(huán)境的差異造成的生理性狀的不穩(wěn)定的難題，通過(guò)單個(gè)關(guān)鍵基因的導(dǎo)入分別獲得具有一個(gè)優(yōu)良生理性狀的材料，從而克服不同品種間的遺傳障礙，既花費(fèi)低，又便于育種者實(shí)施，通過(guò)花藥的培養(yǎng)，將自然和人工條件下篩選的材料穩(wěn)定，不僅減少了工作量，而且克服了常規(guī)雜交育種周期長(zhǎng)的不足，從提高了選種的精準(zhǔn)性和育種效率。具體實(shí)施方式實(shí)施例1 γ-ECS基因向蘇滬香粳的轉(zhuǎn)入2003年，將玉米的，γ-ECS基因轉(zhuǎn)入，具體方法如下將蘇滬香粳的水稻成熟種子去殼，經(jīng)75％酒精處理1min后用0.1％氯化汞溶液浸泡15min，再用無(wú)菌水漂洗3遍，接種到以M8為基本培養(yǎng)基，激素的種類(lèi)與配比的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上(誘導(dǎo)成熟胚愈傷組織的配方為M8+2mg/L2，4-D1mg/LABA+1mg/L6-BA，3％蔗糖+7％瓊脂)28℃黑暗條件下培養(yǎng)30d。從種子胚盾片部位切下誘導(dǎo)出的黃白色致密愈傷組織，浸入到攜帶γ-ECS基因的農(nóng)桿菌株GV3010的菌液中，浸染5分鐘，然后共培養(yǎng)48h，再接入含有500mg/L頭孢霉素和50mg/L的卡那霉素的篩選培養(yǎng)基中(篩選培養(yǎng)基配方除了含抗生素外，其他的和成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方成分相同)，3 week后，成功轉(zhuǎn)入γ-ECS的愈傷組織即成活成為抗性愈傷組織，沒(méi)有轉(zhuǎn)入基因的愈傷即死亡，將抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中，(分化培養(yǎng)基配方為MS+2，4-D0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+KT2.0mg/L+蔗糖30g/L，pH5.6)，2 week后誘導(dǎo)成苗，即為攜帶γ-ECS的水稻植株。將這些植株種植到大田中，通過(guò)測(cè)定開(kāi)花7天和21天時(shí)劍葉的葉綠素含量和原初光化學(xué)效率(Fv/Fm)，篩選出Fv/Fm衰減不高于10％或葉綠素含量衰減不高于20％的抗早衰材料H1，收種子，為了加快獲得種子，將H1代種子在冬季到海南基地種植，獲得H2代種子，實(shí)現(xiàn)了一年中收獲兩代材料。 將蘇滬香粳和γ-ECS-蘇滬香粳采用基因擴(kuò)增(PCR)的方法首先進(jìn)行基因的分子鑒定，γ-ECS基因的表達(dá)是以該基因在相同質(zhì)量下基因擴(kuò)增的量為標(biāo)準(zhǔn)判定的，根據(jù)NCBI基因銀行獲得γ-ECS的登陸號(hào)為AJ302783.，通過(guò)該基因的序列設(shè)計(jì)了一個(gè)右邊界PCR引物，引物的序列為5’-AGGAGCGCCACTAAGTTCAA和一個(gè)左邊界的引物，引物序列為5’-TGCAAAGTTGCCTTTCCCTTT，通過(guò)PCR的方法鑒定，以未轉(zhuǎn)基因的蘇滬香粳的基因表達(dá)電泳圖片的黑白的亮度為1，與轉(zhuǎn)γ-ECS的水稻材料對(duì)比，獲得轉(zhuǎn)基因的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果(參見(jiàn)表1)顯示γ-ECS-蘇滬香粳與未轉(zhuǎn)基因的蘇滬香粳相比，具有明顯的抗早衰性。 表1 γ-ECs-蘇滬香粳抗早衰性的鑒定所述的抗早衰特性主要是通過(guò)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和葉綠素含量的衰減判定。 葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的測(cè)定用FMS2熒光儀(Hansatech，UK)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)。作用光1200μmol·m-2·s-1，飽和脈沖光4000μmol·m-2·s-1，閃光(0.9μmol·m-2·s-1)2s，間隔30s，每個(gè)材料3次重復(fù)。熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)按下式計(jì)算Fv/Fm(Fm-F0)Fm，其中F0為初始熒光強(qiáng)度，F(xiàn)m為最大熒光強(qiáng)度，F(xiàn)v為可變熒光強(qiáng)度。原初光化學(xué)效率的衰減＝(Fv/Fm7-Fv/Fm21)/Fv/Fm7)*100％葉綠素含量的測(cè)定于水稻開(kāi)花的第一天開(kāi)始掛牌，在開(kāi)花的第7天和21天，分別取劍葉上10個(gè)葉圓片，每個(gè)葉圓片直徑為0.5cm，放入10ml96％的乙醇中在容量瓶中抽提，在暗中30℃抽提7天，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定665和649nm的光吸收，從而測(cè)定葉片的葉綠素含量，葉綠素的衰減＝(Chl7-Chl21)/Chl7)*100％實(shí)施例2 γ-ECS-蘇滬香粳/轉(zhuǎn)PEPC基因水稻的F1的獲得2004年，以實(shí)施例1獲得的具有抗早衰的材料H2種質(zhì)作為母本，根據(jù)焦德茂、高東迎、李霞等申請(qǐng)的ZL01138012.8號(hào)專(zhuān)利公開(kāi)的方法獲得的具有C4植物PEPC基因穩(wěn)定表達(dá)的水稻種質(zhì)為父本，通過(guò)雜交，獲得112粒雜種F1種子。 實(shí)施例3高光效和抗早衰特性的F1篩選2004年冬季在海南種植了全部由實(shí)施例2獲得的112粒雜種F1材料，通過(guò)在抽穗期鑒定葉片的PEPC活性、光合速率，在開(kāi)花期測(cè)定劍葉開(kāi)花后第7天和21天后葉綠素含量以及Fv/Fm，篩選出55株高光效和抗早衰的水稻材料F1材料，篩選出的材料PEPC活性均在260～1099μmol/mgChl.h之間，光合速率數(shù)值在17.2～29.8μmol/m2.s之間，F(xiàn)v/Fm衰減在5％～10％、葉綠素含量衰減在12-20％，均具有高光合效率和抗早衰特性，證明可以通過(guò)有性雜交，獲得組合兩種優(yōu)良生理特性的材料。 高光效特性的鑒定是通過(guò)測(cè)定C4光合酶PEPC活性和葉片光合速率。 光合速率的測(cè)定用LI-6400光合測(cè)定系統(tǒng)，測(cè)定水稻孕穗期連體倒2葉的光合CO2氣體交換。氣源為壓縮空氣(CO2體積分?jǐn)?shù)為350μl/L)，光源為鹵素?zé)簦ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)燈與葉室之間的距離來(lái)改變到達(dá)葉表面的光強(qiáng)。燈與葉室之間有一流動(dòng)水槽以減少到達(dá)葉室的溫度(葉室溫度保持在30℃，相對(duì)濕度為60％)，光量子通量密度(PFD)、系統(tǒng)CO2體積分?jǐn)?shù)均由該系統(tǒng)直接測(cè)出，測(cè)定800μmol/m2.s光強(qiáng)下的光合速率，每一點(diǎn)測(cè)定4-6個(gè)重復(fù)。 PEPC活性的測(cè)定取水稻抽穗...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李霞，周月蘭，王超，孫志偉，郭士偉，何冰，焦德茂，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：84[中國(guó)|南京]
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