一種有核細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種人體骨髓或臍帶血中有核細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法，該試劑盒中包含有紅細(xì)胞沉淀劑、泛影酸鈉－聚蔗糖４００↑［＃］或ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ１０７７和細(xì)胞保養(yǎng)液，各試劑溶液分開(kāi)保存。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的試劑盒既能分離骨髓又能分離臍帶血，而且所分離出的細(xì)胞表面沒(méi)有任何標(biāo)記物，不改變細(xì)胞的生物活性。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)可工業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了人類(lèi)造血技術(shù)的工業(yè)化生產(chǎn)，使醫(yī)生可以象用藥一樣方便的使用細(xì)胞來(lái)治療病人，便于推廣實(shí)用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物醫(yī)學(xué)
，特別是涉及一種人體骨髓或臍帶血中有核細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法。
技術(shù)介紹
骨髓和臍帶血是人的造血組織，含有豐富的各系造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞及大量的成熟細(xì)胞，如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等，各系干細(xì)胞又因?yàn)楦髯员砻嫠械目乖圆煌梢苑譃橐话俣喾N，如CD34、CD117、CD10、SCA-1、Lin-等。各系干細(xì)胞和成熟的白細(xì)胞均為有核細(xì)胞。有核細(xì)胞中包含單核細(xì)胞，多核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞及各系干細(xì)胞/祖細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞等。目前國(guó)際國(guó)內(nèi)從骨髓、臍帶血中分離提取干細(xì)胞的方法很多有按照細(xì)胞的類(lèi)型分離的，如單純分離單核細(xì)胞、分離間充質(zhì)干細(xì)胞、分離淋巴細(xì)胞等，有按其細(xì)胞表面抗原不同分離某一類(lèi)干細(xì)胞的，如分離CD34、CD117、CD10等，所采用的方法有磁珠法，免疫熒光標(biāo)記法，富選法，流式細(xì)胞儀法等。這些方法所存在的共同問(wèn)題是第一不能有效保留所有類(lèi)型的干細(xì)胞，第二造價(jià)貴，第三技術(shù)條件要求較高，離工業(yè)化生產(chǎn)有一定的距離，在臨床推廣應(yīng)用上有一定的難度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種從人類(lèi)骨髓和臍帶血中分離有核細(xì)胞的體外分離試劑盒，該技術(shù)不僅具有方法簡(jiǎn)單，造價(jià)低廉，可以工業(yè)化生產(chǎn)，易于推廣的特點(diǎn)，最重要的可以保留骨髓和臍帶血中所有的造血干細(xì)胞。本專(zhuān)利技術(shù)的另一是目的提供采用上述試劑盒分離有核細(xì)胞的分離方法。本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案為一種有核細(xì)胞體外分離試劑盒，其特征在于該試劑盒中包含有紅細(xì)胞沉淀劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077和細(xì)胞保養(yǎng)液，各試劑溶液分開(kāi)保存；所述紅細(xì)胞沉淀劑是指由0.4％～1.2％的羥乙基淀粉或羧甲基淀粉或甲基纖維素與0.2％～0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，該水溶液PH為7～8所述泛影酸鈉-聚蔗糖400#由0.3％～1.5％泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400#組成的水溶液，鈣水溶液PH值為7～8；所述細(xì)胞保養(yǎng)液為磷酸緩沖液或生理鹽水；上述有核細(xì)胞體外分離試劑盒的應(yīng)用方法，其工藝過(guò)程為首先用細(xì)胞保養(yǎng)液將骨髓或臍帶血稀釋?zhuān)缓笈c紅細(xì)胞沉淀劑混勻，靜置8～20分鐘后收取上清液，離心濃縮，濃縮液再加入泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077后離心分離20～30分鐘，吸取有核細(xì)胞層，用細(xì)胞保養(yǎng)液清洗1～4次即可。本專(zhuān)利技術(shù)既能分離骨髓又能分離臍帶血，所分離出的有核細(xì)胞存活率≥98％，有核細(xì)胞回收率≥85％，如果能按無(wú)菌要求操作，在局部100級(jí)潔凈工作臺(tái)中，分離不會(huì)因試劑而污染而且所分離出的細(xì)胞表面沒(méi)有任何標(biāo)記物，不改變細(xì)胞的生物活性。本專(zhuān)利技術(shù)的試劑盒可工業(yè)化生產(chǎn)，以實(shí)現(xiàn)了人類(lèi)造血干細(xì)胞分離、純化技術(shù)的推廣，使醫(yī)生可以象用藥一樣方便的使用細(xì)胞來(lái)治療病人。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1試劑盒組成1、紅細(xì)胞沉淀劑0.4％的羧甲基淀粉與0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，溶液PH值7.4；2、泛影酸鈉-聚蔗糖400#0.3％的泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400#組成的水溶液，其PH值為7。3、細(xì)胞保養(yǎng)液磷酸緩沖液(PBS)；上述三種液體配制后經(jīng)過(guò)121℃，35分鐘滅菌，測(cè)試內(nèi)毒素含量≤0.5EU/ml，后分別存放在試劑盒中。取100ml骨髓或臍帶血，加100ml細(xì)胞保養(yǎng)液稀釋?zhuān)?0ml紅細(xì)胞沉淀劑混勻后靜置8～20分鐘，收取上清液，以1200轉(zhuǎn)/8分鐘的速率離心濃縮。吸取濃縮液加到含有泛影酸鈉-聚蔗糖400#的離心管中，做密度梯度離心30分鐘，轉(zhuǎn)速控制在1200轉(zhuǎn)/分，吸取有核細(xì)胞層，再用細(xì)胞保養(yǎng)液清洗1～4次，用50ml細(xì)胞保養(yǎng)液稀釋備用，取5μ1用臭酚藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞存活率.再取5μ1進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每100ml骨髓或臍帶血分離的細(xì)胞總數(shù)不應(yīng)少于2.6-5.9×107個(gè)細(xì)胞。上述濃度為質(zhì)量濃度。實(shí)施例2試劑盒組成1、紅細(xì)胞沉淀劑1.2％的羥乙基淀粉與0.2％的葡萄糖酸鈣加水溶解所得的溶解液，PH值8；2、HISTOPAQUE1077；3、細(xì)胞保養(yǎng)液生理鹽水；上述三種液體配制后經(jīng)過(guò)121℃，35分鐘滅菌，測(cè)試內(nèi)毒素含量≤0.5EU/ml，后分別存放在試劑盒中。具體應(yīng)用方法同實(shí)施例1。上述濃度為質(zhì)量濃度。實(shí)施例3試劑盒組成1、紅細(xì)胞沉淀劑0.8％的甲基纖維素與0.3％的葡萄糖酸鈣加水溶解所得的溶解液，PH值8；2、泛影酸鈉-聚蔗糖400#；3、細(xì)胞保養(yǎng)液磷酸緩沖液(PBS)；上述三種液體配制后經(jīng)過(guò)121℃，35分鐘滅菌，測(cè)試內(nèi)毒素含量≤0.5EU/ml，后分別存放在試劑盒中。具體應(yīng)用方法同實(shí)施例1。上述濃度為質(zhì)量濃度。權(quán)利要求1.一種有核細(xì)胞體外分離試劑盒，其特征在于該試劑盒中包含有紅細(xì)胞沉淀劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077和細(xì)胞保養(yǎng)液，各試劑溶液分開(kāi)保存。2.按照權(quán)利要求1所述的有核細(xì)胞體外分離試劑盒，其特征是所述紅細(xì)胞沉淀劑是指由0.4％～1.2％的羥乙基淀粉或羧甲基淀粉或甲基纖維素與0.2％～0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，該水溶液PH為7～8。3.按照權(quán)利要求1所述的有核細(xì)胞體外分離試劑盒，其特征是所泛影酸鈉-聚蔗糖400#由0.3％～1.5％泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400#組成的水溶液，該水溶液PH值為7～8。4.按照權(quán)利要求1所述的有核細(xì)胞體外分離試劑盒，其特征是所述細(xì)胞保養(yǎng)液為磷酸緩沖液或生理鹽水。5.一種如權(quán)利要求1所述的有核細(xì)胞體外分離試劑盒的應(yīng)用方法，其工藝過(guò)程為首先用細(xì)胞保養(yǎng)液將骨髓或臍帶血稀釋?zhuān)缓笈c紅細(xì)胞沉淀劑混勻，靜置8～20分鐘后收取上清液，離心濃縮，濃縮液再加入泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077后離心分離20～30分鐘，吸取有核細(xì)胞層，用細(xì)胞保養(yǎng)液清洗1～4次即可。全文摘要本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種人體骨髓或臍帶血中有核細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法，該試劑盒中包含有紅細(xì)胞沉淀劑、泛影酸鈉－聚蔗糖400文檔編號(hào)C12N5/0786GK1920012SQ20061010687公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2006年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月7日專(zhuān)利技術(shù)者王懷林 申請(qǐng)人:王懷林本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種有核細(xì)胞體外分離試劑盒，其特征在于該試劑盒中包含有紅細(xì)胞沉淀劑、泛影酸鈉－聚蔗糖４００↑［＃］或ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ１０７７和細(xì)胞保養(yǎng)液，各試劑溶液分開(kāi)保存。

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王懷林，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：王懷林，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：64[中國(guó)|寧夏]