尿液中冠心病的蛋白標志物及其用途制造技術

本發明專利技術公開了尿液中冠心病的蛋白標志物及其用途。進一步地，本發明專利技術公開了選自以下的蛋白的鑒定試劑在制備用于診斷受試者的冠心病的試劑中的用途：TFF1、APOD及其組合。本發明專利技術公開的兩種蛋白在冠心病的大規模篩選具有較好的應用前景，具有利用尿液的無創取材優勢。

Protein markers of coronary heart disease in urine and its use

The present invention discloses the protein marker of coronary heart disease in urine and its use. Further, the invention discloses the use of the identification reagent selected from the following protein in preparing the reagent for diagnosing the coronary heart disease of the subjects: TFF1, APOD and their combinations. The two kinds of protein disclosed in this invention have good application prospect in large scale screening of coronary heart disease, and have the advantage of using the non - invasive extraction of urine.

【技術實現步驟摘要】
尿液中冠心病的蛋白標志物及其用途
本專利技術涉及生物
，更具體地，涉及尿液中冠心病的蛋白標志物及其用途。
技術介紹
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病，以動脈粥樣硬化為主要特征的冠心病及其并發癥致病率及致死率較高已引起人們廣泛關注。伴隨疾病發生過程，動脈粥樣硬化到一定時期便會發展成心肌梗死及中風，直接威脅人們生命。在其惡化之前進行疾病早期診斷對于病情的控制及治療至關重要。目前，早期心血管疾病診斷方法，諸如心電、超聲、傳統的冠脈造影技術、冠狀動脈計算機斷層掃描血管造影技術等對于監測疾病嚴重程度有著良好的靈敏性和特異性，但這些方法有造價高，侵襲性強，不適用于大規模臨床樣本的監測診斷。通過對冠心病的細胞生物學和分子生物學的研究已經揭示了動脈粥樣硬化惡化的過程中的很多作用機制。如脂蛋白和炎癥因子的變化、血管細胞微環境糖代謝的變化，具體如粘附分子捕獲血液中的白細胞，內皮細胞通透性增強，單核細胞轉化成巨噬細胞同時刺激其對低密度脂蛋白顆粒的吸收，最終導致泡沫細胞的形成。氧化型低密度脂蛋白可誘導動脈粥樣硬化過程中一些潛在的炎癥反應發生。LXR家族蛋白通過促進膽固醇的流出和逆向轉運阻止巨噬細胞中泡沫細胞的形成。低密度脂蛋白中的S100A8鈣離子結合蛋白(MRP8)與動脈粥樣硬化信號轉導相關。S100A8與S100A9與長期的炎癥反應、白細胞黏附遷移、以及內皮細胞中脂肪酸的攝取過程密切相關，隨著動脈粥樣硬化的惡化，泡沫細胞和炎癥細胞的聚集，以及細胞碎片和膽固醇凝結會形成壞死中心，同時平滑肌細胞和細胞外基質大分子會形成纖維帽覆蓋纖維化的動脈粥樣硬化斑塊，動脈血管壁內的壞死中心和纖維化斑塊將導致血管內低氧環境，使氧氣和血管內能量代謝的主要來源-葡萄糖的運送受阻。但這些基于細胞、血液、組織的研究結果尚無開展大規模臨床檢測的實例，究其原因主要因素為生物樣本復雜程度性和取材的限制，雖然基于免疫方法的ELISA可以進行大規模的檢測，但受限于抗體滴度和特異性的影響，在定量的結果上也有待商榷。因此目前迫切開發一種非侵襲性樣本獲取，能提供相對準確的定性和定量數據，可用于監測診斷動粥樣硬化患者病情的臨床診斷方法。近年，尿液不僅應用于惡性腫瘤標記物檢測分析中，在心腦血管疾病研究中也開始被采用。尿液相比其他臨床材料，如心血管組織、細胞系、血液，具有處理方法簡便，非侵襲性獲取的優點，所以是一種很好的樣本來源。與血液樣本不同，尿液中含有較少的白蛋白和免疫球蛋白等高豐度蛋白，能夠減少疾病標記物發現過程中高豐度蛋白對中低豐度蛋白鑒定的干擾。另外，尿液樣本不僅包含血漿中的成分，還含有許多不同反應通路的系統代謝物，含有相對較全的生物信息。基于以上優勢，采用尿蛋白質組學策略打開了發現心血管疾病相關蛋白質的一個新的窗口。多反應監控(MultipleReactionMonitor,MRM)是一種基于二級質譜信號的靶標質譜定量分析技術，它不需要特殊的化學標記輔助，能夠同時進行絕對和相對定量測定。靶標質譜技術能夠同時對多種蛋白質進行定性和定量分析，從而克服了基于免疫方法對抗體特異性和滴度的限制。在本專利技術中通過收集了冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者和健康對照組各9例的尿液樣品，采用標記定量蛋白質組學分析策略進行冠心病尿液差異蛋白質的篩選。除了鑒定到APOE等冠心病相關蛋白質外，還發現雖然同源家族的其他蛋白質曾報道和心腦血管疾病相關，但尿液中TFF1和APOD和冠心病的相關性并無明確報道。其中，TFF1(三葉草因子1)該家族蛋白質序列特點都是含有三個保守二硫鍵的40個氨基酸長度的片段，主要分布在消化系統上皮中，其具體作用機理尚不明確，但發現其在多種腫瘤中表達水平異常的現象，該蛋白在冠心病中表達情況尚無報道。APOD(載脂蛋白D)隸屬載脂蛋白家族，主要功能是結合和轉運脂質，此外還參與脂蛋白受體的識別、調節脂蛋白代謝酶活性等過程。在本專利技術中對鑒定到的差異蛋白質開發了基于靶標質譜技術同時對TFF1和APOD等蛋白質檢測的方法，利用僅單獨存在于這兩種蛋白質的特異性標簽肽段，篩選母子離子對，對質譜數據結果的統計分析，發現尿液TFF1和APOD的靶標質譜數據結果對冠心病和健康對照組具有很好的區分度，因無TFF1和APOD單獨或聯合應用作為檢測冠心病的先例，本專利技術開發包含尿液標準蛋白質酶解產物、檢測蛋白質標簽肽段離子對列表、酶解等主要實驗試劑的檢測試劑盒，本專利技術的研究結果對于冠心病的大規模篩選具有較好的應用前景。上述對
技術介紹
的陳述僅是為了方便對本專利技術技術方案(使用的技術手段、解決的技術問題以及產生的技術效果等方面)的深入理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域技術人員所公知的現有技術。
技術實現思路
鑒于本領域的上述需求，根據本公開的一些實施方案，提供了蛋白的鑒定試劑在制備用于診斷冠心病的試劑中的用途，其中所述的蛋白選自TFF1、APOD及其組合。在具體的實施方案中，相較于健康對照，選自以下的蛋白的表達水平降低指示所述受試者患有冠心病：TFF1、APOD及其組合。其中，健康對照是指未患有冠心病的個體。在具體的實施方案中，適用于本公開的鑒定試劑是質譜鑒定試劑、抗體或其抗原結合片段。在具體的實施方案中，抗體是單克隆抗體。本公開對單克隆抗體的物種來源沒有限制，任何能夠結合上述蛋白的抗體均可以使用。在具體的實施方案中，抗原結合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、ScFv、雙特異抗體、三特異抗體、四特異抗體、雙-scFv。任何保留了抗原結合活性的抗體片段均適用于本公開。在具體的實施方案中，所述質譜鑒定試劑是在多反應監控中使用的。多反應監控是一種基于二級質譜信號的靶標質譜定量分析技術，能夠同時進行絕對和相對定量測定，它不需要特殊的抗體，從而克服了基于免疫方法對抗體特異性和滴度的限制。多反應檢測技術能夠同時對多種蛋白質進行定性和定量分析。在具體的實施方案中，所述質譜鑒定試劑選自：SEQIDNO:3所示的TFF1的標簽肽的鑒定試劑、SEQIDNO:4所示的APOD的標簽肽的鑒定試劑、及其組合。在具體的實施方案中，SEQIDNO:3所示的TFF1的標簽肽的位置3和位置13的半胱氨酸具有氨乙酰化修飾的半胱氨酸。標簽肽是指能夠代表某一個蛋白的肽段，其特征在于存在且特異性僅存在于某蛋白質氨基酸序列中。在具體的實施方案中，表達水平是指蛋白表達水平。在具體的實施方案中，表達水平是在受試者的尿液樣本中測定的。在具體的實施方案中，所述受試者是人。本專利技術的另一方面提供了一種用于診斷冠心病的試劑盒，其包含選自以下的蛋白的鑒定試劑：TFF1、APOD及其組合。在具體的實施方案中，所述鑒定試劑是質譜鑒定試劑、抗體或其抗原結合片段，優選所述抗體是單克隆抗體。在具體的實施方案中，所述質譜鑒定試劑在多反應監控中使用的。在具體的實施方案中，所述質譜鑒定試劑選自：SEQIDNO:3所示的TFF1的標簽肽的鑒定試劑、SEQIDNO:4所示的APOD的標簽肽的鑒定試劑、及其組合。在具體地實施方案中，用于診斷冠心病的試劑盒還包含0.25-0.75μg/μl的胰蛋白酶、40-60mM的NH4HCO3、ACN、1-3μg/μl的內標LysC肽段。優選地，用于診斷冠心病的試劑盒還包含0.5μg本文檔來自技高網...

【技術保護點】
選自以下的蛋白的鑒定試劑在制備用于診斷受試者中冠心病的試劑中的用途：TFF1、APOD及其組合。

【技術特征摘要】
1.選自以下的蛋白的鑒定試劑在制備用于診斷受試者中冠心病的試劑中的用途：TFF1、APOD及其組合。2.根據權利要求1所述的用途，其中相較于健康對照，選自以下的蛋白的表達水平降低指示所述受試者患有冠心病：TFF1、APOD及其組合。3.根據權利要求1或2所述的用途，其中所述鑒定試劑是質譜鑒定試劑、抗體或其抗原結合片段，優選所述抗體是單克隆抗體。4.根據權利要求3所述的用途，其中所述質譜鑒定試劑是在多反應監控中使用的。5.根據權利要求4所述的用途，其中所述質譜鑒定試劑選自：SEQIDNO:3所示的TFF1的標簽肽的鑒定試劑、SEQIDNO:4所示的APOD的標簽肽的鑒定試劑、及其組合。6.根據權利要求1至5中任一項所述的用途，其中所述表達水平是在所述受試者的尿液樣本中測定的蛋白表達水平；所述受試者是人。7.一種用于診斷冠...

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫偉，曾勇，孫海丹，王丹琪，劉東方，郭正光，邵晨，
申請(專利權)人：中國醫學科學院基礎醫學研究所，
類型：發明
國別省市：北京,11