用缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的突變菌株生產(chǎn)色氨酸的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)舒述了用缺乏Ｌ－絲氨酸脫氨酶活性的突變菌株，特別是從廣泛可利用的親本微生物如：大腸桿菌，得到的這種突變菌株生產(chǎn)色氨酸的方法．（*該技術(shù)在2005年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)是有關(guān)用缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的突變菌株生產(chǎn)色氨酸的方法。下面稱之為L-絲氨酸脫氨酶，它的活性本質(zhì)與尿酸梭菌分離出的一種酶相似。它已被命名為EC4，2，1，14，下面稱之為L-絲氨酸脫氨的活性，參見卡特(Carter J·F·)和塞耶斯(Sa-yers·R·D)的文章“尿酸梭菌”、發(fā)表在細(xì)菌學(xué)雜志(J·Bacte-rial)109期，757-763頁(1972年)。專利技術(shù)特別與利用L-絲氨酸脫氨酶(L-SD)活性缺乏的大腸桿菌K12的幾個(gè)突變菌株有關(guān)。用微生物從碳水化合物中生產(chǎn)L-色氨酸現(xiàn)有技術(shù)中有兩種方法來完成。第一個(gè)是選擇抗色氨酸及類似物的反饋物的野生型微生物的突變菌株。這種方法的例子包括抗-5氟色氨酸的一個(gè)枯草芽桿菌的菌株(Bacillus substilis)。(見美國專利4，363，875)抗5-甲基色氨酸的短桿菌屬的一些種(Brevi bacterium)(見美國專利3，700，539);及其它需要苯丙氨酸和酪氨酸，並且抗4-甲基色氨酸、6-氟色氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-氟色氨酸、酪氨酸-氧酸鹽(酯)和苯丙氨酸-氧酸鹽(酯)的各氨酸棒桿菌(ATCC21851)。后一個(gè)菌株可以利用15克/10毫升甘蔗赤糖糊密糖轉(zhuǎn)化的蔗糖生產(chǎn)出16.8毫克/升的色氨酸。第二個(gè)增加色氨酸生產(chǎn)的方法是提供一個(gè)質(zhì)粒和幾個(gè)質(zhì)粒上攜帶控制色氨酸生物合成遺傳信息給宿主微生物。后一個(gè)方法的例子是美國專利4，371，614所述的通過攜帶色氨酸生物合成信息的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏色氨酸酶的大腸桿菌宿主〔EC4、1，99，1〕。不論用于色氨酸合成的微生物是一個(gè)突變菌株還是轉(zhuǎn)化菌株，色氨酸都是通過下列途徑合成的圖表1 鄰氨基苯甲酸是在色氨酸生物合成途徑的第一個(gè)主要前體。生產(chǎn)色氨酸的最后一步是色氨酸合成酶參與了一個(gè)吲哚-3-磷酸甘油分子和一個(gè)絲氨酸分子縮合，成色氨酸和3-磷酸甘油醛。人們發(fā)現(xiàn)，在微生物中通過吲哚-3-磷酸甘油集中起來的色氨酸前體庫是很多的。絲氨酸的供應(yīng)決定著色氨酸的生產(chǎn)率。一般絲氨酸生物合成是沿下列途徑進(jìn)行的。圖表23-磷酸甘油酸3-磷酸羥基丙酮酸3-磷酸紅氨酸(葉酸)絲氨酸 甘氨酸L-絲氨酸脫水酶丙酮酸(L-絲氨酸脫氨酶)丙酮酸乙酰輔酶A絲氨酸在幾條途徑里被消耗。一條是絲氨酸通過四氫葉酸反應(yīng)轉(zhuǎn)化成甘氨酸。另一條主要降解途徑是L-絲氨酸脫氨酶作用于絲氨酸導(dǎo)致產(chǎn)生丙酮酸和乙酰輔酶A。在尿酸梭菌中，L-絲氨酸脫氨酶被認(rèn)為是尿酸發(fā)酵途徑的一種酶。該酶一般在一系列絲氨酸生成和它作為主要碳素代謝部分的進(jìn)一步代謝活動中起作用。L-絲氨酸脫氨酶的水平隨著氮素營養(yǎng)，碳源和氨基酸可利用程度而改變。L-絲氨酸脫氨酶活動的誘導(dǎo)物是很具特征性的。這些誘導(dǎo)物包括氮素的缺乏，甘氨酸和亮氨酸的存在(但不是絲氨酸，因?yàn)樗挥绊懜拾彼岷土涟彼岬恼T導(dǎo))，和在葡萄糖基本培養(yǎng)基上的生長。在生產(chǎn)氨基酸最廉價(jià)的葡萄糖基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，L-絲氨酸脫氨酶的水平是高的。(參見紐曼(Newman F·B·)和卡普爾(Kapo-or·V·的文章“大腸桿菌K12菌株中L-絲氨酸脫氨酶活性的離體研究”刊載在加拿大生化雜志(Can·J·Biochem·)58期，1292-1297頁，(1980年)。據(jù)信它通過脫氨作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)絲氨酸水平的下降，保持絲氨酸庫處于低水平，避免了絲氨酸對L-蘇氨酸脫氨酶的抑制作用。(參見伊森伯格(Isenberg'S·)和紐曼(NewmanE·B·)的文章“大腸菌K12菌株中L-絲氨酸脫氨酶的研究”，載在細(xì)菌學(xué)雜志118期，53-58頁(1974年)。可以肯定的是在有L-絲氨酸脫氨酶存在時(shí)，大腸桿菌K12菌株不可逆地把L-絲氨酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸或者一個(gè)和丙酮酸處于同一氧化水平的化合物。既使L-絲氨酸脫氨酶的一個(gè)自然底物，它也能在生理上有意義的反應(yīng)中被L-絲氨酸脫氨酶降解(參見紐曼(Newman'E·B·)和沃克(Wa-lker'C·)文章“在大腸桿菌K12菌株中L-絲氨酸的降解L-絲氨酸，甘氨酸和亮氨酸聯(lián)合作為碳源”，刊載在細(xì)菌學(xué)雜志151期777-782頁(1982年)。絲氨酸對色氨酸生物合成或絲氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的可利用性可以通過利用缺乏絲氨酸降解酶的微生物得到加強(qiáng)。葉酸鹽缺乏的微生物從代謝的觀點(diǎn)來看過于應(yīng)激反應(yīng)以致于在培養(yǎng)中不能繼續(xù)維持。然而，缺乏L-絲氨酸脫氨酶的微生物可以繼續(xù)培養(yǎng)，并用來，并用來作為加強(qiáng)色氨酸生物合成的微生物來源。L-絲氨酸脫氨酶缺乏活性的微生物在色氨酸生產(chǎn)中的有用性特別是體現(xiàn)在那些被修飾為增強(qiáng)色氨酸生產(chǎn)的微生物。例如，一些在美國專利4，371，614中被揭示的微生物，其中用攜帶色氨酸生物合成信息的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的色氨酸酶活性缺乏的大腸桿菌K12菌株在生產(chǎn)色氨酸時(shí)就比未加修飾的大腸桿菌菌株產(chǎn)量高得多。在這些菌株中色氨酸生產(chǎn)的限制因子是L-絲氨酸的降解及是否通過微生物合成它或是否通過L-絲氨酸脫氨酶從外源來供應(yīng)它。在美國專利4，371，164揭述的菌株及其它為增加色氨酸生產(chǎn)而修飾了的菌株可以通過在L-絲氨酸脫氨酶缺乏活性的菌株中生長的噬菌體P，用它轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生色氨酸的菌株，再篩選出降低L-絲氨酸脫氨酶活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)體或增加色氨酸生產(chǎn)或二者兼有之的轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株進(jìn)一步增加色氨酸的生產(chǎn)。專利技術(shù)者制造和分離了一些微生物菌株，特別是革蘭氏陰性菌，像L-絲氨酸脫氨酶活性缺乏或幾乎沒有的大腸桿菌。術(shù)語“L-絲氨酸脫氨酶活性缺乏菌株”在此是指微生物中L-絲氨酸脫氨酶活性低于野生型親本的菌株。(L-絲氨酸脫氨酶活性的測定是用后面例子中描述的方法進(jìn)行的)。根據(jù)這個(gè)定義，L-絲氨酸脫氨酶活性缺乏菌株中該酶活性在5個(gè)毫單位或更低(在后面的例子中確定)。L-絲氨酸脫氨酶活性缺乏的大腸桿菌菌株不能在含絲氨酸，甘氨酸或亮氨酸的基質(zhì)上生長，當(dāng)它生長在葡萄糖基本培養(yǎng)基上缺乏L-絲氨酸脫氨酶的活性。根據(jù)本專利技術(shù)，大腸桿菌K12菌株暴露在紫外線照射或利用增變噬菌體Mu的dx轉(zhuǎn)座子(Mudx)插入到大腸桿菌K12菌株后的轉(zhuǎn)座子諉變再適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上篩選出缺乏L-絲氨酸脫氨酶的突變菌株。根據(jù)專利技術(shù)所敘述的程序提供了一個(gè)從廣泛可利用的微生物中制造和分離缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的突變菌株的方法。這些可以利用的微生物包括革蘭氏陰性菌如大腸桿菌。圖Ⅰ是一個(gè)表示不同氨基酸的不同濃度與181-34菌株產(chǎn)量關(guān)系的曲線圖。圖Ⅱ是質(zhì)粒PD2643內(nèi)切酶切點(diǎn)圖解。從下面例子我們可以更好地理解專利技術(shù)。例Ⅰ1、MEW128菌株的分離一個(gè)在ilva部分缺失的野生型大腸桿菌CU1008菌株是從美國密蘇里州圣路易斯市華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院威廉斯先生(L·S·Wi-lliams)處得到的。MEW 128菌株用紫外光照射CU1008菌株，再根據(jù)戴維斯(Davis'B·D·)等人的方法在含青霉素并含絲氨酸2毫克/毫升，甘氨酸200微克/毫升，亮氨酸50微克/毫升的葡萄糖培養(yǎng)基上在37℃下繼代培養(yǎng)。(參見“用青霉素分離生化缺陷型細(xì)菌”，刊在美國化學(xué)協(xié)會雜志70卷4267頁(1948)。把殘存者轉(zhuǎn)移到葡萄糖基本培養(yǎng)基，用影印法篩選并在添加了如上配方中含量的絲氨酸，甘氨酸、和亮氨酸的細(xì)菌甲瓊脂(Bacto-Agar)培養(yǎng)基上培養(yǎng)(稱之為SGL-平板培養(yǎng)基)。MEW128菌株由于不能在SGL-平板上生本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種生產(chǎn)Ｌ－色氨酸的方法，其特征是利用缺乏Ｌ－絲氨酸脫氨酶活性的突變菌株。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征是利用缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的突變菌株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用的突變菌株是幾乎沒有L-絲氨酸脫氨酶活性的菌株。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用的突變菌株含有一個(gè)與L-絲氨酸脫氨酶活性有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因突變。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是其中的結(jié)構(gòu)基因突變是一個(gè)插入突變。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是其中的插入突變是插入了抗氯霉素和氨芐青霉素的噬菌體Mudx·(Mudx CAM(APrlac)6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用的突變菌株含有一個(gè)與L-絲氨酸脫氨酶活性有關(guān)的調(diào)節(jié)基因突變。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是其中的調(diào)節(jié)基因突變是一個(gè)插入突變。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是其中的插入突變是插入了抗氯霉素和氨芐青霉素的噬菌體Mudx(Mudx CAM(APrlan)9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用的突變菌株含有一個(gè)與L-絲氨酸脫氨酶活性有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因突變和一個(gè)與該酶活性有關(guān)的調(diào)節(jié)基因突變。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征是其中所說的與L-絲氨酸脫氨酶有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因突變是一個(gè)插入突變。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其特征是其中所說的結(jié)構(gòu)基因的插入突變是插入了抗氯霉素和氨芐青霉素的噬菌體Mudx(Mudx CAM(APrlac))。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征是其中所說的與L-絲氨酸脫氨酶有關(guān)的調(diào)節(jié)基因突變是一個(gè)插入突變。13.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征是其中所說的調(diào)節(jié)基因的插入突變是插入了抗氯霉素和氨芐青霉素的噬菌體Mudx(Mudx CAM(APrlac))。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征是其中所用的突變菌株是屬于大腸桿菌的一些種(Escherichia Coli)。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述方法，其特征是其中所用的大腸桿菌是K12菌株。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征是其中所用的菌株是需要硫胺素的菌...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：伊萊恩紐曼，
申請(專利權(quán))人：斯托弗化學(xué)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：US[美國]