一種蠶豆根瘤菌株系Bdz5?3及其應用，該菌株是從新鮮的蠶豆根瘤中分離純化得到的，屬于根瘤菌屬Rhizobium?anhuiense株系。該菌株系于2017年10月23日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO：M?2017612。本發明專利技術的根瘤菌株系Bdz5?3是一種共生固氮能力強、對四川蠶豆品種適應范圍廣，兼具有分泌IAA、溶無機磷和有機磷能力、抗逆性強的優良廣譜蠶豆根瘤菌菌株；與四川的主栽蠶豆品種匹配親和性好，在四川不同品種的蠶豆生產中，不施氮肥、接種Bdz5?3使蠶豆增產33.2％以上，與不接種對照的差異達顯著水平。
A strain of Vicia faba root nodule strain Bdz5-3 and its application
A strain of Vicia faba root nodule strain Bdz5 3 and its application were isolated and purified from the fresh root nodules of broad bean and belong to the Rhizobium anhuiense strain of the genus rhizobia. The strain was preserved in the typical Chinese Culture Preservation Center of Wuhan University in October 23, 2017, with the number of CCTCC NO:M NO:M 2017612. The Rhizobium strain Bdz5 3 of the present invention is an excellent broad-spectrum broad bean Rhizobium strain with strong nitrogen fixation ability, wide adaptation to Sichuan broad bean variety and strong ability to secrete IAA, dissolved inorganic phosphorus and organophosphorus, and strong resistance to adversity. It has good compatibility with the main broad bean varieties in Sichuan and the production of broad bean in different varieties of Sichuan. The yield of broad bean increased by more than 33.2% without nitrogen fertilizer and inoculated with Bdz5 3.
【技術實現步驟摘要】
一種蠶豆根瘤菌株系Bdz5-3及其應用
本專利技術涉及微生物領域，具體涉及一種蠶豆根瘤菌株系Bdz5-3及其應用。
技術介紹
中國是最大的蠶豆生產國，干蠶豆產量占世界35％(FAO2014)，是我國傳統對外貿易的重要農產品資源，出口量在全國雜糧中居第二(劉玉皎等，2002)。四川省蠶豆播種面積約30萬公頃，僅次于云南，總產達6億公斤(楊武云，2003)。以蠶豆為原材料的四川郫縣豆瓣全國聞名，需求量大，每年所需蠶豆達12萬噸，但現在主要靠從外地進口。除了收獲干蠶豆，也可以收鮮蠶豆作為經濟價值較高的蔬菜，還可以用作綠肥，因此在四川種植蠶豆具有很大潛力，但是，近年來由于氮素肥料的大量投入使用，導致生產面積逐年下降，產量也較西方國家有所下降，并且氮素肥料生產成本高、利用率低，同時污染生態環境，不利于生態環境的保護和農業的可持續發展。豆科作物接種匹配高效的根瘤菌是國際上公認的一種有效的生物固氮技術，生物固氮優質，利用率高，釋放氮素過程持續，后效長，浪費少，對環境無污染(葛誠，2007)，有利于生態環境的保護和農業的可持續發展，前人研究認為，蠶豆—根瘤菌這一共生體系固定氮素量大，其生長所需80％的氮素均來自于根瘤菌固氮，一個生長季節能夠固定并提供約200KgN/ha，遠遠高于大豆(100KgN/ha)(Hardarsonetal，2003)。韓梅等(2016)在青海省接種根瘤菌可以顯著地提高蠶豆的產量，增加土壤肥力；王文麗等(2010)在甘肅省的蠶豆生產中接種根瘤菌以后較不接種處理生物量增加了6.48％～12.86％。面對化肥零增長及減施增效的重大科技需求，蠶豆的生產是可以用匹配的高效根瘤菌來實現優質高產的。由于根瘤菌的群體分布具有地理局限性，需要注意其對應用地區環境的適應能力(陳文新等，2004)。一般來說，在某個區域內最為有效的根瘤菌往往來自本地區或者與本地區條件相似地區的菌株(崔雅琪，2014；陳文新等，2011)。因此，在根瘤菌高效固氮菌株的篩選中，不僅要考慮根瘤菌與豆科植物品種的匹配性，還必須重視菌劑應用的地域性。現有研究表明，極少數根瘤菌還具有溶磷、分泌生長激素(IAA)等促生特性。師尚禮(2007)等對730余株苜蓿根瘤菌進行研究，僅從這29株根瘤菌篩選到10株分泌IAA能力強的根瘤菌，對這29株菌進行溶磷能力的測定，發現全部菌株沒有溶解無機磷的能力，這29個苜蓿根瘤菌都能夠溶解有機磷，但溶磷能力差異較大，僅8個菌株有較強的溶解有機磷的能力，其余菌株有弱或微弱的溶有機磷的能力。目前有關蠶豆高效根瘤菌的篩選應用，除了青海、甘肅地區(刁治民，2002；韓梅等，2010；王文麗等，2010)、及河北地區(王瑞，2016)有相關性報道外，還未見其他報道。為此，針對四川的主栽品種進行蠶豆廣譜優良菌株的篩選，對四川蠶豆生產中充分發揮生物固氮作用，篩選優良菌株資源，減少化肥施用或不施氮肥，同時對于保護生態環境，推動農業可持續發展具有重要實踐價值。
技術實現思路
針對現有技術的不足，本專利技術的目的是提供一種高效固氮的蠶豆根瘤菌株系Bdz5-3，具有分泌IAA、一定溶磷能力，并有較好的田間生產應用前景。本專利技術采取的技術方案：一種蠶豆根瘤菌株系Bdz5-3，其分類命名為RhizobiumanhuienseBdz5-3，于2017年10月23日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCCNO：M2017612。所述蠶豆根瘤菌株系Bdz5-3應用于四川蠶豆主產區成都平原地區蠶豆的生產。本專利技術的有益效果：本專利技術的根瘤菌株系Bdz5-3是一種共生固氮能力強、對四川蠶豆品種適應范圍廣，兼具有分泌IAA、溶無機磷和有機磷能力、抗逆性強的優良廣譜蠶豆根瘤菌菌株；與四川的主栽蠶豆品種匹配親和性好，在四川不同品種的蠶豆生產中，不施氮肥、接種Bdz5-3使蠶豆增產33.2％以上，與不接種對照的差異達顯著水平。附圖說明圖1為蠶豆根瘤菌株系Bdz5-3在YMA培養基上的菌落形態；圖2為蠶豆根瘤菌株系Bdz5-3的16SrRNA基因序列的系統發育圖；圖3為蠶豆根瘤菌株系Bdz5-3的glnII、atpD、recA三個持家基因聯合構建的系統發育圖。具體實施方式實施例1根瘤菌的分離、純化和保存從四川省達州市宣漢縣砂土上種植的蠶豆中，選擇健壯植株主根上大且飽滿紅色的根瘤，將根瘤擦洗干凈，帶部分根皮采下，用紙吸干并將其放在裝有無水氯化鈣并覆有脫脂棉的小管中。在實驗室將采集的根瘤用無菌水浸泡吸脹后，用95％的乙醇處理5min，接著用0.1％m/v的升汞表面滅菌5min，再用無菌水沖洗6次，在無菌操作的情況下，將單個根瘤夾破后在加有剛果紅的YMA培養基(甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH2PO40.25g，MgSO4.7H2O0.2g，CaCl2.6H2O0.1g，NaCl0.1g，鉬酸鈉(1％)2ml，硼酸(1％)2ml，剛果紅(1％)2.5ml，瓊脂18～20g，水1000ml，pH6.8-7.0)上劃線，在28℃的恒溫箱中培養。待長出菌落后，從平板上挑選不吸紅、形態上像根瘤菌的菌落在平板上稀釋劃線培養。3d左右觀察菌落形態，一直觀察到15d左右，因慢生根瘤菌需7～15d出現菌落。重復稀釋劃線反復分離，直到純化為止。根據以下兩方面進行初步判定是否為根瘤菌：(1)加剛果紅的YMA培養基上的菌落形態：不吸紅，菌落圓形、乳白色、隆起、邊緣整齊不蔓延、表面光滑、較粘稠、較濕潤。培養3-5d就長出菌落的為快生根瘤菌，培養5-10長出菌落的為慢生根瘤菌。(2)細胞形態：對確認的根瘤菌菌落作標記，制片進行革蘭氏染色，根瘤菌的鏡檢結果為細胞呈小桿狀且形態一致，無芽孢，細胞內常含β-羥基丁酸而呈環節狀，革蘭氏陰性(G-)。如果上述標記菌落具有上述兩方面特征，則將該菌落接入YMA培養基的試管斜面培養保存。本實施例分離純化得到的菌株Bdz5-3為快生根瘤菌，在加剛果紅的YMA培養基上培養，菌體不吸紅，菌落較小、圓形、乳白色、粘稠、隆起度較高、稍透明，3～4d長出菌落。經革蘭氏染色鏡檢為G-，呈小桿狀。實施例2根瘤菌的回接及匹配性試驗根瘤菌的回接試驗用的蠶豆品種是“大白蠶豆”，在光照室(控溫22～24℃，光照強度2700～3000勒克斯，日照時間14hr)進行，種植46d收獲。與“大白蠶豆”回接成功后再與其他的主栽蠶豆品種(“成胡14”，“成胡15”)進行匹配親和性試驗，也用水培法進行。在上述光照室培養41d收獲。定期補充無菌無氮營養液。將快生蠶豆根瘤菌Bdz5-3與上述蠶豆品種形成不同組合，水培器采用250ml的細頸瓶(醫院用的玻璃輸液瓶)，以不接種所述蠶豆根瘤菌的同品種植株為對照。收獲后用蠶豆植株的根瘤數及植株干重來評價蠶豆根瘤菌Bdz5-3的接種效果。回接試驗與匹配性試驗的菌液培養、種子的催芽、水培器的制作及種植方法一致。(1)菌液培養：將上述蠶豆根瘤菌Bdz5-3接種于YMA液體培養基中，放置搖床上用120rpm/min轉速，28℃培養至對數生長期(約3-4d)。(2)種子的催芽：選擇粒大、飽滿的無損傷的蠶豆種子，用95％酒精浸5min，倒去酒精，加入0.1％的升汞溶液表面滅菌5min，最后用無菌水清洗4～6次，每次5min，28℃催芽，待主根長到本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種蠶豆根瘤菌株系Bdz5?3，其特征在于：于2017年10月23日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO：M?2017612。
【技術特征摘要】
1.一種蠶豆根瘤菌株系Bdz5-3，其特征在于：于2017年10月23日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCCNO：M2017612。2.根據權利要求1所述的蠶豆根瘤菌株系Bdz5-3的應用，其特征...
【專利技術屬性】
技術研發人員：徐開未，陳遠學，全紫曼，徐禎，彭丹，劉明，廖金山，王科，
申請(專利權)人：四川農業大學，
類型：發明
國別省市：四川,51
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