一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法及應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法及應(yīng)用，構(gòu)建的生物膜反應(yīng)器以多孔隙的珍珠巖作為成膜載體，具有接觸面積大價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，以新鮮的合成礦物鹽培養(yǎng)基作為微生物的成膜環(huán)境；本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)利用單一特定的砷氧化效率極高的菌株構(gòu)建了一個(gè)高效穩(wěn)定的生物膜反應(yīng)器，該生物膜反應(yīng)器能夠在5小時(shí)內(nèi)完全將20mg/L?As(III)氧化成As(V)，該氧化效率在之前所有單株生物膜反應(yīng)器中是最高的；本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)為篩選生物膜反應(yīng)器最佳的砷鹽氧化細(xì)菌提供了新的方向，對(duì)環(huán)境中的砷污染問(wèn)題的修復(fù)具有重要意義。

Construction and application of a biofilm reactor for acid-resistant arsenic-oxidizing bacteria community

The invention discloses a construction method and application of an acid-resistant arsenic-oxidizing bacterial community biofilm reactor, which uses porous perlite as a film-forming carrier, has the advantages of large contact area and low cost, and uses fresh synthetic mineral salt medium as the film-forming environment of microorganisms; the invention uses a single specific strain with high arsenic oxidation efficiency to construct the biofilm reactor. An efficient and stable biofilm reactor can completely oxidize 20mg/L As(III) to As(V) in 5 hours. The oxidation efficiency of the biofilm reactor is the highest in all previous single biofilm reactors. The present invention provides a new direction for screening the best arsenic salt oxidizing bacteria in the biofilm reactor and is of great significance for the remediation of arsenic pollution in the environment.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法及應(yīng)用
本專(zhuān)利技術(shù)屬于高砷地下水修復(fù)
，具體涉及一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
近年來(lái)，利用砷氧化微生物構(gòu)建的生物反應(yīng)器氧化去除砷污染水體中的砷受到了很大的關(guān)注，一些固定化的砷氧化微生物被應(yīng)用到砷氧化膜生物反應(yīng)器中。相關(guān)技術(shù)中，一種采用化能自養(yǎng)砷氧化菌構(gòu)建的生物反應(yīng)器能夠在8小時(shí)內(nèi)將200μg/LAs(III)幾乎全部氧化，但不適合在酸性環(huán)境下使用。酸性礦井水會(huì)對(duì)礦業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境等造成嚴(yán)重危害，當(dāng)酸性礦井水未經(jīng)處理直接排出，進(jìn)入地表水體以后，會(huì)造成水質(zhì)惡化，嚴(yán)重影響人民的飲水安全。在酸性環(huán)境中，砷氧化生物膜反應(yīng)器的砷氧化的穩(wěn)定性較差、氧化效率低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
有鑒于此，本專(zhuān)利技術(shù)的實(shí)施例提供了一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法及應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例采用的技術(shù)方案是，一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)制備確定含有耐酸砷氧化細(xì)菌群落的混合菌液；(2)以珍珠巖顆粒作為成膜載體，填充于反應(yīng)器中，反應(yīng)器置于恒溫器內(nèi)，將上述混合菌液加入反應(yīng)器至浸沒(méi)所述珍珠巖顆粒，并通入氧氣，攪拌至混合液與珍珠巖顆粒混合均勻；(3)向上述反應(yīng)器中加入新鮮的MMM培養(yǎng)基，定期更換所述MMM培養(yǎng)基，耐酸砷氧化細(xì)菌群落在珍珠巖顆粒上形成生物膜；(4)向上述反應(yīng)器中加入合成地下水，培養(yǎng)一定時(shí)間后耐酸砷氧化細(xì)菌群落在生物膜上富集，得到生物膜反應(yīng)器。優(yōu)選地，所述步驟(1)中，通過(guò)適量酸性土壤在MMM培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)得到含有耐酸砷氧化細(xì)菌群落的混合菌液。優(yōu)選地，所述步驟(2)中，珍珠巖顆粒的直徑為0.2～0.4cm。本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例還提供了上述方法構(gòu)建的生物膜反應(yīng)器的應(yīng)用，應(yīng)用于高砷地下水的修復(fù)。與相關(guān)技術(shù)比較，本專(zhuān)利技術(shù)提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是：本專(zhuān)利技術(shù)提供的生物膜反應(yīng)器以多孔隙的珍珠巖作為成膜載體，具有接觸面積大價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，以新鮮的合成礦物鹽培養(yǎng)基作為微生物的成膜環(huán)境；本專(zhuān)利技術(shù)利用極端酸性環(huán)境下的砷氧化效率極高的菌株群落構(gòu)建了一個(gè)高效穩(wěn)定的生物膜反應(yīng)器，該生物膜反應(yīng)器能夠在5小時(shí)內(nèi)完全將20mg/LAs(III)氧化成As(V)。附圖說(shuō)明圖1是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例生物膜反應(yīng)器構(gòu)建方法流程圖；圖2是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例制備的耐酸砷氧化細(xì)菌的氧化能力示意圖；圖3是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例構(gòu)建生物膜反應(yīng)器的裝置示意圖；圖4是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例構(gòu)建的生物膜反應(yīng)器內(nèi)微生物群落組成示意圖；圖5是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例制備的珍珠巖生物膜與干凈的珍珠巖顆粒顯微鏡示意圖；圖6是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例構(gòu)建的生物膜反應(yīng)器修復(fù)高砷合成地下水的示意圖。具體實(shí)施方式為使本專(zhuān)利技術(shù)的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施方式作進(jìn)一步地描述。實(shí)施例一請(qǐng)參考圖1，本專(zhuān)利技術(shù)的實(shí)施例提供了一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)制備確定含有耐酸砷氧化細(xì)菌群落的混合菌液；通過(guò)適量酸性土壤在MMM培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)得到的，所述混合菌液中富集耐酸砷氧化細(xì)菌；培養(yǎng)基的pH值為4.0±0.1；碳源來(lái)于牛奶和酵母提取物；(2)以珍珠巖顆粒作為成膜載體，填充于反應(yīng)器中，反應(yīng)器置于恒溫器內(nèi)，將上述混合菌液加入反應(yīng)器至浸沒(méi)所述珍珠巖顆粒，并通入氧氣，攪拌至混合液與珍珠巖顆粒混合均勻；珍珠巖顆粒的直徑為0.2～0.4cm；(3)向上述反應(yīng)器中加入新鮮的MMM培養(yǎng)基，定期更換所述MMM培養(yǎng)基，耐酸砷氧化細(xì)菌群落在珍珠巖顆粒上形成生物膜；(4)向上述反應(yīng)器中加入合成地下水，培養(yǎng)一定時(shí)間后耐酸砷氧化細(xì)菌群落在生物膜上富集，得到生物膜反應(yīng)器。本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例還提供了上述方法構(gòu)建的生物膜反應(yīng)器的應(yīng)用，應(yīng)用于高砷地下水的修復(fù)。實(shí)施例二根據(jù)本專(zhuān)利技術(shù)的實(shí)施例一的方法構(gòu)建一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器，包括以下步驟：(1)取5g石門(mén)酸性土壤加入到100mL的MMM培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)得到富含耐酸砷氧化細(xì)菌的混合菌液；其中，培養(yǎng)基的pH值為4.0±0.1，砷濃度為5mmol/L；碳源來(lái)源于有機(jī)碳源10mmol/L的牛奶和0.02％酵母提取物；參照附圖2，耐酸砷氧化細(xì)菌可將三價(jià)砷完全氧化為五價(jià)砷；(2)以珍珠巖顆粒作為成膜載體，填充于玻璃反應(yīng)器中，反應(yīng)器置于30℃恒溫器內(nèi)，將上述混合菌液加入反應(yīng)器至浸沒(méi)所述珍珠巖顆粒；參照附圖3，從氧氣瓶中以0.2MPa的壓力向玻璃反應(yīng)器內(nèi)供氧，利用蠕動(dòng)泵以60.0mL/min的流速攪拌玻璃反應(yīng)器中的混合液，使其混合均勻；其中，玻璃反應(yīng)器的直徑為7cm，高為15cm，蠕動(dòng)泵和氧氣瓶之間采用直徑為8mm的14#硅膠泵管連接；(3)向玻璃反應(yīng)器中加入新鮮的MMM培養(yǎng)基，每隔一周更換新鮮的MMM培養(yǎng)基，持續(xù)三周，耐酸砷氧化細(xì)菌群落在珍珠巖上形成生物膜；同時(shí)，每周檢測(cè)培養(yǎng)基中砷氧化的狀況；所述MMM培養(yǎng)基，其成分為：3.0gKH2PO4、3.0gNa2HPO4、1.0gNH4Cl、0.3gMgSO4·7H2O、0.5gKCl、0.01gCaCl2、10.0ml維生素溶液、5.0ml微量元素溶液，加去離子水至1000.0ml，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，所述MMM固體培養(yǎng)基通過(guò)在MMM培養(yǎng)基內(nèi)加入1.5％瓊脂得到；(4)向玻璃反應(yīng)器中加入合成地下水，持續(xù)培養(yǎng)三周，使耐酸砷氧化細(xì)菌群落在生物膜上富集，即得到生物膜反應(yīng)器；其中，合成地下水中的As(III)的濃度為20.0mg/L；合成地下水的成分為：9mg/LNH4Cl、6mg/LKNO3、3.16mg/LH3PO3、1.21mg/LSrCl26H2O、0.02mg/L(NH4)6MoO24·4H2O、18mg/LMnCl2·4H2O、277.5mg/LCaCl2、150mg/LMgSO4、7.8mmol/LNaHCO3、0.01mmol/LFeSO4·7H2O，用硫酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為4。其余同實(shí)施例一。參照附圖4，本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例制備的生物膜反應(yīng)器中存在大量的微生物。實(shí)施例三采用電子顯微鏡觀察本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例一或二中珍珠巖上生物膜的形成，具體過(guò)程為：將1g干凈的珍珠巖顆粒和從生物膜反應(yīng)器中取出的1g含有生物膜的珍珠巖顆粒分別置于10mL離心管中，用0.1mol磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液(pH＝7.2)清洗三次；分別取出珍珠巖顆粒，放置于新的10mL離心管中，用2.5％戊二醛持續(xù)浸泡珍珠巖顆粒4h，使生物膜結(jié)構(gòu)固定；從2.5％戊二醛溶液中分別取出珍珠巖顆粒，用0.1molPBS緩沖液(pH＝7.2)清洗3次，然后用1％鋨酸浸泡珍珠巖顆粒2h，進(jìn)行第二次固定；從鋨酸溶液中分別取出珍珠巖顆粒，分別用濃度為50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇浸泡珍珠巖顆粒，梯度脫水；脫水后的珍珠巖顆粒，先用液氮冷凍，然后將珍珠巖顆粒置于冷凍干燥機(jī)中凍干4h；凍干后樣品放置于金屬托盤(pán)上，拿至真空鍍膜儀中，噴金5min；將噴金完的樣品置于電子顯微鏡下，調(diào)節(jié)顯微鏡工作距離至11mm，加速電壓至20kV，放大倍數(shù)5000倍條件下觀察珍珠巖樣品。參照附圖5，(a)為顯微鏡下從生物膜反應(yīng)器中取出的珍珠巖顆粒的形態(tài)，(b)為顯微鏡下干凈的珍珠巖顆粒的形態(tài)；表明本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例的耐酸砷氧化細(xì)菌在珍珠巖顆粒上形成了比較完整的生物膜。實(shí)施例四將35本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征是，包括以下步驟：(1)制備確定含有耐酸砷氧化細(xì)菌群落的混合菌液；(2)以珍珠巖顆粒作為成膜載體，填充于反應(yīng)器中，反應(yīng)器置于恒溫器內(nèi)，將上述混合菌液加入反應(yīng)器至浸沒(méi)所述珍珠巖顆粒，并通入氧氣，攪拌至混合液與珍珠巖顆粒混合均勻；(3)向上述反應(yīng)器中加入新鮮的MMM培養(yǎng)基，定期更換所述MMM培養(yǎng)基，耐酸砷氧化細(xì)菌群落在珍珠巖顆粒上形成生物膜；(4)向上述反應(yīng)器中加入合成地下水，培養(yǎng)一定時(shí)間后耐酸砷氧化細(xì)菌群落在生物膜上富集，得到生物膜反應(yīng)器。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征是，包括以下步驟：(1)制備確定含有耐酸砷氧化細(xì)菌群落的混合菌液；(2)以珍珠巖顆粒作為成膜載體，填充于反應(yīng)器中，反應(yīng)器置于恒溫器內(nèi)，將上述混合菌液加入反應(yīng)器至浸沒(méi)所述珍珠巖顆粒，并通入氧氣，攪拌至混合液與珍珠巖顆粒混合均勻；(3)向上述反應(yīng)器中加入新鮮的MMM培養(yǎng)基，定期更換所述MMM培養(yǎng)基，耐酸砷氧化細(xì)菌群落在珍珠巖顆粒上形成生物膜；(4)向上述反應(yīng)器中加入合成地下水，培養(yǎng)一定時(shí)間后耐酸砷氧化細(xì)菌群落在生物膜上富集，得到生物膜反應(yīng)器。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征是，所述步驟(1)中，取適量酸性土壤在MMM培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)得到含有耐酸砷氧化細(xì)菌群落的混合菌液；培養(yǎng)基的pH值為4.0±0.1。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征是，所述步驟(1)中，取5g石門(mén)酸性土壤加入到100mL的MMM培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)得到富含耐酸砷氧化細(xì)菌的混合菌液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐酸砷氧化細(xì)菌群落生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征是，所述步驟(2)中，珍珠巖顆粒的直徑為0.2～0.4cm。5.根據(jù)權(quán)利...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：曾憲春，祝賢彬，何忠，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)地質(zhì)大學(xué)武漢，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：湖北,42