一種臍帶膜保存和制備干細(xì)胞的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種從人臍帶最外表面覆蓋的羊膜層制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，分離培養(yǎng)時臍帶膜不需要貼壁處理，所分離的間充質(zhì)干細(xì)胞比普通華通氏膠組織塊貼壁法純度更高。華通氏膠含有一定的成纖維細(xì)胞，其特性與間充質(zhì)干細(xì)胞非常類似，難以純化。人羊膜只含有人羊膜上皮細(xì)胞和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞兩種細(xì)胞類型，上皮細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，傳代培養(yǎng)過程中容易去掉，從而獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞純度更高。本發(fā)明專利技術(shù)從臍帶最外表面覆蓋的羊膜層中提取間充質(zhì)干干細(xì)胞，可有效的對臍帶組織進(jìn)行長期冷凍保存，凍存液充分接觸臍帶膜，最大程度維持了臍帶膜兩側(cè)細(xì)胞的活性，且方便復(fù)蘇使用，尤其是復(fù)蘇后分離間充質(zhì)干細(xì)胞，不需要臍帶膜組織塊的貼壁處理。

A method for preservation and preparation of stem cells from umbilical cord membrane

The invention relates to a method for preparing mesenchymal stem cells from the amniotic membrane covering the outermost surface of human umbilical cord. The umbilical cord membrane does not need adherence treatment when it is isolated and cultured, and the purity of the separated mesenchymal stem cells is higher than that of ordinary Walton's glue tissue block adherence method. Walton's gum contains fibroblasts, which are very similar to mesenchymal stem cells and difficult to purify. Human amniotic membrane contains only human amniotic epithelial cells and human amniotic mesenchymal stem cells, which have strong adherence ability and can be easily removed in the process of subculture, thus obtaining more pure mesenchymal stem cells. The invention extracts mesenchymal stem cells from the amniotic membrane layer covered by the outermost surface of the umbilical cord, which can effectively freeze and preserve the umbilical cord tissue for a long time. The cryopreservation fluid contacts the umbilical cord membrane sufficiently, maintains the activity of the cells on both sides of the umbilical cord membrane to the greatest extent, and is convenient for resuscitation and use, especially for separating the mesenchymal stem cells after resuscitation, and does not need adherence treatment of the umbili

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種臍帶膜保存和制備干細(xì)胞的方法
本專利技術(shù)屬于干細(xì)胞制備
，具體涉及一種人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，尤其涉及從臍帶最外層羊膜中分離間充質(zhì)干細(xì)胞。
技術(shù)介紹
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)起源于發(fā)育早期的中胚層,是一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。MSCs具有免疫原性低、造血支持、炎癥趨化、免疫調(diào)節(jié)和提供營養(yǎng)支持等生物學(xué)特性，在組織損傷，免疫調(diào)控和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛的研究，具有廣闊的應(yīng)用前景。間充質(zhì)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的分化能力，除可分化為脂肪，骨、軟骨、骨骼肌和肌腱等中胚層細(xì)胞外，無論體內(nèi)還是體外，在不同的誘導(dǎo)條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞還可分化為外胚層的神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝卵圓性細(xì)胞。臨床試驗(yàn)表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可歸巢到組織損傷部位，參與多種組織的損傷修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞對固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的多種免疫細(xì)胞都可以進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。間充質(zhì)干細(xì)胞主要通過旁分泌產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子等生物活性物質(zhì)以及細(xì)胞與細(xì)胞間的直接接觸等方式共同對靶細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)控，調(diào)控的細(xì)胞類型包括巨噬細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用在移植物抗宿主病，自身免疫性疾病和預(yù)防器官移植免疫排斥等方面發(fā)揮重要的作用。間充質(zhì)干細(xì)胞最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)從多種組織中分離提取，例如臍帶，脂肪，牙髓，胎盤，羊水，肌肉，肺，肝和胰腺等組織中都能分離到間充質(zhì)干細(xì)胞。臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞有其獨(dú)特的優(yōu)勢：增殖能力強(qiáng)，能快速滿足臨床需要的細(xì)胞數(shù)量；免疫原性低，異體移植不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)；采集方便，對供體無傷害，易于保存和運(yùn)輸；提取和分離簡單，病毒污染概率低，細(xì)胞分離培養(yǎng)的純度高。臍帶表面被羊膜覆蓋，呈白色，光滑而濕潤，有時局部表面會有一些隆起。在妊娠期間人臍帶連接母體和胎兒，為胎兒的發(fā)育提供營養(yǎng)，臍帶主要由三部分構(gòu)成：羊膜被覆上皮、兩條臍帶動脈和一條臍帶靜脈血管以及位于上皮和血管之間的華通氏膠（Wharton'sJelly）結(jié)締組織。華通氏膠的主要成分是膠原、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素（其中膠原占干重的50%以上，以I、II、III型膠原為主），含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞和少量的成纖維細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的來源包括：最外層的羊膜，羊膜下層，華通氏膠，臍帶動脈和靜脈血管周圍組織。血管周圍為含水量豐富的華通膠有保護(hù)臍帶血管的作用，也可分離提取到間充質(zhì)干細(xì)胞。目前的制備方法中應(yīng)用最為廣泛的是華通氏膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。此外，人羊膜所含的細(xì)胞類型包括人羊膜上皮細(xì)胞（humanamnioticepithelialcells）和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(humanamnioticmesenchymalstemcells)兩種。目前從臍帶中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法。酶消化法是采用混合酶包括膠原酶、胰蛋白酶、玻璃酸酶中的一種或幾種對剪碎的臍帶組織進(jìn)行消化。消化液中的胰蛋白酶是通過對粘蛋白和糖蛋白等細(xì)胞骨架成分進(jìn)行消化，從而使細(xì)胞分離，但對細(xì)胞間質(zhì)的蛋白成分及細(xì)胞膜蛋白均有很強(qiáng)的破壞作用。酶消化法雖然短時間內(nèi)可以獲得細(xì)胞，但費(fèi)用高，消化的時間不好掌握，常溫消化需要的時間長，容易造成分離的間充質(zhì)干細(xì)胞受到損傷導(dǎo)致活性不佳；37℃消化需要的時間短，但液體粘稠，則難以擴(kuò)增出理想數(shù)目。組織塊貼壁法操作簡便，對實(shí)驗(yàn)條件要求低，易于掌握，該方法的缺點(diǎn)是獲得原代細(xì)胞周期長，液體的浮力使組織塊漂起后，喪失爬出細(xì)胞的能力，分離的細(xì)胞數(shù)量減少。專利201010528733.4公開了一種從臍帶華通氏膠利用組織塊貼壁法分離制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法分離的間充質(zhì)干細(xì)胞可能含有部分來自于華通氏膠的成纖維細(xì)胞。專利201010605542.3公開了一種從臍帶華通氏膠利用酶消化法分離制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法分離的間充質(zhì)干細(xì)胞可能含有部分自于華通氏膠的成纖維細(xì)胞。專利201210159919.6公開了一種凍存和復(fù)蘇臍帶全細(xì)胞并分離和擴(kuò)增干細(xì)胞的方法，該方法是用酶消化法，消化整個臍帶組織塊，分離和擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞中會含有血管內(nèi)皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等細(xì)胞類型。專利201510171887.5公開了一種從臍帶羊膜下層組織中分離制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。該方法不采用消化酶又不同于常規(guī)貼壁法，可以制備出高純度、高活性的間充質(zhì)干細(xì)胞。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所提取間充質(zhì)干細(xì)胞來自于臍帶最外層的羊膜，豐富了從臍帶提取間充質(zhì)干細(xì)胞的來源，此外本專利技術(shù)提取的間充質(zhì)干細(xì)胞純度更高，具有更強(qiáng)的增殖和分化潛能。華通氏膠中除可提取到豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞外，還含有少量成纖維細(xì)胞。1991年，McElreavey,KD首次在臍帶中發(fā)現(xiàn)具有成纖維樣的細(xì)胞，之后有多位學(xué)者從臍帶中分離到成纖維細(xì)胞。2003年，MitchellKE，首先證實(shí)從臍帶提取的間充質(zhì)干細(xì)胞具有多項分化潛能。2016年，RyanA.Denu通過大量的研究表明成纖維細(xì)胞其特性與間充質(zhì)干細(xì)胞非常相似，難以將兩種細(xì)胞分離開。人臍帶最外層的羊膜只含有人羊膜上皮細(xì)胞和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞兩種細(xì)胞類型，上皮細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，傳代培養(yǎng)過程中容易去掉，從而克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種新的臍帶制備間充質(zhì)干細(xì)胞的來源。此外，本專利技術(shù)的專利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸和制備環(huán)節(jié)低氧環(huán)境對于間充質(zhì)干細(xì)胞干性的維持起到重要作用。凍存前剝離臍帶被覆的羊膜上皮，凍存時凍存液充分接觸臍帶膜，最大程度維持了臍帶膜兩側(cè)細(xì)胞的活性，且方便復(fù)蘇使用。尤其是復(fù)蘇后分離間充質(zhì)干細(xì)胞，不需要臍帶膜組織塊的貼壁處理，該方法操作更為簡單。本專利技術(shù)的一種臍帶膜保存和制備干細(xì)胞的方法，包括以下步驟。（1）臍帶的采集：經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，在產(chǎn)房無菌條件下，健康產(chǎn)婦胎兒娩出后即刻按產(chǎn)科常規(guī)結(jié)扎斷臍的方法截取不少于20cm長的臍帶。用臍帶清洗液沖洗臍帶，再用醫(yī)用酒精消毒，將臍帶置于臍帶保存盒中于2-8℃醫(yī)用取血箱恒溫保存。從母體抽取4ml外周血，用于病毒檢測；從胎盤端抽取4ml臍帶血，用于微生物檢測。（2）臍帶的運(yùn)輸和接收：將母血檢測樣本、臍帶血檢測樣本和裝有臍帶的保存盒通過冷鏈運(yùn)輸送達(dá)生物樣本庫的實(shí)驗(yàn)室。為最大限度保證細(xì)胞的活性，樣本入庫時間越短越好，所有樣本要在48h內(nèi)入庫。實(shí)驗(yàn)室接收樣本后，將臍帶血和母血檢測樣本移交質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物檢測和病毒檢測。（3）臍帶膜的制備：采集的臍帶血和母血檢測樣本檢測合格后，將臍帶移交至制備實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行臍帶膜的分離制備。臍帶首先用75%的酒精進(jìn)行消毒，然后用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)沖洗表面；用手術(shù)刀將臍帶切成2~3cm的小段，用鈍性鑷子剝離臍帶血管后，手術(shù)刀片刮去臍帶羊膜下層的華通氏膠，剩下薄薄一層透明的臍帶表皮即臍帶羊膜，將臍帶膜切成0.5cm×0.5cm的片狀。（4）凍存液的配制：所述凍存液包含10%的DMSO（二甲基亞砜），DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，人血白蛋白，滲透性冷凍保護(hù)劑包括二甲基亞砜，乙二醇，丙二醇和甘油中的一種或幾種的組合。配好的凍存液放置于4℃冰箱低溫保存。（5）臍帶膜的程控降溫：制備好的臍帶膜，浸入2-8℃預(yù)冷的凍存保護(hù)液中，臍帶膜和凍存液按1:1的體積比裝入凍存管中。將凍存管放入程控降溫儀進(jìn)行預(yù)冷，開始凍存程序，將溫度降至-90℃后取出凍本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種臍帶膜保存和制備干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：（1）臍帶膜的處理和冷凍保存方法：1）臍帶的采集：經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，在產(chǎn)房無菌條件下，健康產(chǎn)婦胎兒娩出后即刻按產(chǎn)科常規(guī)結(jié)扎斷臍的方法截取不少于20cm長的臍帶，用臍帶清洗液沖洗臍帶，再用醫(yī)用酒精消毒，將臍帶置于臍帶保存盒中于2?8℃醫(yī)用取血箱恒溫保存，從母體抽取4ml外周血，用于病毒檢測；從胎盤端抽取4ml臍帶血，用于微生物檢測；2）臍帶的運(yùn)輸和接收：將母血檢測樣本、臍帶血檢測樣本和裝有臍帶的保存盒通過冷鏈運(yùn)輸送達(dá)生物樣本庫的實(shí)驗(yàn)室，為最大限度保證細(xì)胞的活性，樣本入庫時間越短越好，所有樣本要在48h內(nèi)入庫，實(shí)驗(yàn)室接收樣本后，將臍帶血和母血檢測樣本移交質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物檢測和病毒檢測；3）臍帶膜的制備：待步驟2）中臍帶血和母血檢測樣本檢測合格后，將臍帶移交至制備實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行臍帶膜的分離制備，臍帶首先用75%的酒精進(jìn)行消毒，然后用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)沖洗表面；用手術(shù)刀將臍帶切成2~3cm的小段，用鈍性鑷子剝離臍帶血管后，手術(shù)刀片刮去臍帶羊膜下層的華通氏膠，將臍帶膜切成0.5cm×0.5cm的片狀；4）臍帶膜的凍存：步驟3）中制備好的臍帶膜，浸入2?8℃預(yù)冷的凍存保護(hù)液中，臍帶膜和凍存液按1:1的體積比裝入凍存管中，將凍存管放入程控降溫儀進(jìn)行預(yù)冷，開始凍存程序，將溫度降至?90℃后取出凍存樣本，放入液氮儲存罐長期保存；（2）臍帶膜復(fù)蘇分離提取間充質(zhì)干細(xì)胞：5）臍帶膜的復(fù)蘇：將裝有臍帶膜的凍存管從液氮中取出后，置于37℃水浴鍋中解凍2?5分鐘，將臍帶膜用復(fù)蘇清洗液洗滌2?4次后接種至含有完全培養(yǎng)基的六孔板中；6）間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)：將接種臍帶膜組織片的六孔板置于37℃、含5%的CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后首次進(jìn)行半量換液，之后每3天換液一次，7?12天左右培養(yǎng)板底部可觀察到有細(xì)胞貼壁生長；7）傳代培養(yǎng)：待原代細(xì)胞生長至細(xì)胞融合度80?90%后用含0.05~0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，消化液經(jīng)100目濾網(wǎng)過濾，去掉臍帶組織片，獲得含臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的濾液，依次傳代培養(yǎng)，可獲得4?6代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種臍帶膜保存和制備干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：（1）臍帶膜的處理和冷凍保存方法：1）臍帶的采集：經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，在產(chǎn)房無菌條件下，健康產(chǎn)婦胎兒娩出后即刻按產(chǎn)科常規(guī)結(jié)扎斷臍的方法截取不少于20cm長的臍帶，用臍帶清洗液沖洗臍帶，再用醫(yī)用酒精消毒，將臍帶置于臍帶保存盒中于2-8℃醫(yī)用取血箱恒溫保存，從母體抽取4ml外周血，用于病毒檢測；從胎盤端抽取4ml臍帶血，用于微生物檢測；2）臍帶的運(yùn)輸和接收：將母血檢測樣本、臍帶血檢測樣本和裝有臍帶的保存盒通過冷鏈運(yùn)輸送達(dá)生物樣本庫的實(shí)驗(yàn)室，為最大限度保證細(xì)胞的活性，樣本入庫時間越短越好，所有樣本要在48h內(nèi)入庫，實(shí)驗(yàn)室接收樣本后，將臍帶血和母血檢測樣本移交質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物檢測和病毒檢測；3）臍帶膜的制備：待步驟2）中臍帶血和母血檢測樣本檢測合格后，將臍帶移交至制備實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行臍帶膜的分離制備，臍帶首先用75%的酒精進(jìn)行消毒，然后用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)沖洗表面；用手術(shù)刀將臍帶切成2~3cm的小段，用鈍性鑷子剝離臍帶血管后，手術(shù)刀片刮去臍帶羊膜下層的華通氏膠，將臍帶膜切成0.5cm×0.5cm的片狀；4）臍帶膜的凍存：步驟3）中制備好的臍帶膜，浸入2-8℃預(yù)冷的凍存保護(hù)液中，臍帶膜和凍存液按1:1的體積比裝入凍存管中，將凍存管放入程控降溫儀進(jìn)行預(yù)冷，開始凍存程序，將溫度降至-90℃后取出凍存樣本，放入液氮儲存罐長期保存；（2）臍帶膜復(fù)蘇分離提取間充質(zhì)干細(xì)胞：5）臍帶膜的復(fù)蘇：將裝有臍帶膜的凍存管從液氮中取出后，置于37℃水浴鍋中解凍2-5分鐘，將臍帶膜用復(fù)蘇清洗液洗滌2-4次后接種至含有完全培養(yǎng)基的六孔板中；6）間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)：將接種臍帶膜組織片的六孔板置于37℃、含5%的CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后首次進(jìn)行半量換液，之后每3天換液一次，7-12天左右培養(yǎng)板底部可觀察到有細(xì)胞貼壁生長；7）傳代培養(yǎng)：待原代細(xì)胞生長至細(xì)胞融合度80-90%后用含0.05~0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，消化液經(jīng)100目濾網(wǎng)過濾，去掉臍帶組織片，獲得含臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的濾液，依次傳代培養(yǎng)，可...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃慶雷，鄧鉞，沈麗，
申請(專利權(quán))人：北京弘潤天源基因生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：北京,11