本發明專利技術涉及基因工程中的基因編輯技術領域，具體涉及一種用于果蠅CRISPR轉基因的cas9轉錄模板DNA及質粒DNA和體外轉錄方法。該cas9轉錄模板DNA具有如SEQ?ID?NO：1所示的堿基序列。本發明專利技術圍繞CRISPR/Cas9技術在模式動物果蠅中的應用，提供了一種優化的Cas9的表達載體，顯著地提高了基因編輯效率，也為其在其他領域的應用奠定了基礎。
Cas9 transcription template DNA, plasmid DNA and in vitro transcription method for Drosophila CRISPR gene
The invention relates to the field of gene editing technology in genetic engineering, in particular to cas9 transcription template DNA and plasmid DNA for Drosophila CRISPR transgene and in vitro transcription method. The cas9 transcription template DNA has a base sequence as shown in SEQ ID NO:1. The invention provides an optimized Cas9 expression vector around the application of CRISPR/Cas9 technology in model animal Drosophila melanogaster, which significantly improves the efficiency of gene editing and lays a foundation for its application in other fields.
【技術實現步驟摘要】
用于果蠅CRISPR轉基因的cas9轉錄模板DNA及質粒DNA和體外轉錄方法
本專利技術涉及基因工程中的基因編輯
，更具體地，涉及一種用于果蠅CRISPR轉基因的cas9轉錄模板DNA及質粒DNA與應用和體外轉錄方法。
技術介紹
傳統的轉基因技術主要是利用轉座的原理，將外源DNA片段隨機地整合到生物基因組上，很難做到精確地修改(即基因編輯)。繼轉基因技術之后出現了ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技術，都基于核酸內切酶精確地靶向基因組DNA的原理，均能實現對基因組的精確修飾，成為目前主流的三大基因編輯技術。相對于ZFN和TALEN技術，CRISPR/Cas9技術的操作更簡單、成本更低廉、效率更高，成為目前基因編輯的首選。CRISPR/Cas9基因編輯技術，是由細菌中行使免疫功能的CRISPR/Cas9系統改造而來。主要通過一段引導RNA(singleguideRNA，sgRNA)，將Cas9核酸內切酶引導到目標片段，并進行切割，再利用生物體自身的非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HR)修復機制實現對基因組的修飾和編輯，包括小片段插入刪除(indel)、較大片段DNA刪除(deletion)、特定位置添加序列標簽、單堿基替換等等。利用CRISPR/Cas9技術，可以構建目標基因功能缺失(KO)突變體、用于檢測目的基因表達的工具品系、用于精確分析單個氨基酸功能的單堿基修飾品系等，大大加快了生物學研究的進度。除了應用于科研領域，CRISPR/Cas9基因編輯技術還被應用于細胞治療、牲畜改良、作物改良等與人們生活息息相關的健康、環境和能源領域，具有廣闊的應用前景。目前，影響CRISPR/Cas9技術效率的主要因素之一是Cas9的活性。因此，亟需一種方法能夠提高Cas9的活性，從而提高基因編輯的效率。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種Cas9的表達載體及體外轉錄方法，具有高的基因編輯效率。為了實現上述目的，本專利技術的第一方面提供一種用于果蠅CRISPR轉基因的cas9轉錄模板DNA，該cas9轉錄模板DNA具有如SEQIDNO：1所示的堿基序列。所述cas9轉錄模板DNA為密碼子優化后的cas9轉錄模板DNA。具體是將人源cas9密碼子優化為果蠅適應的密碼子，提高cas9-mRNA在果蠅體內的翻譯效率，從而提高cas9蛋白表達水平。優化所采用的工具網站：http://www.jcat.de/。將優化所得序列進行基因合成，最終得到果蠅密碼子優化后的cas9CDS轉錄模板DNA。本專利技術的第二方面提供一種用于果蠅CRISPR轉基因的質粒DNA，該質粒DNA包括以下元件：cas9轉錄基因，所述cas9轉錄基因具有如SEQIDNO：1所示的堿基序列；第一40-nls入核信號，位于所述cas9轉錄基因起始密碼子ATG之后，cas9轉錄基因之前；第二40-nls入核信號，位于所述cas9轉錄基因中止密碼子之前，cas9轉錄基因之后；Kozak序列，所述Kozak序列位于所述起始密碼子ATG之前；T7啟動子；sv40-3UTR，所述sv40-3UTR位于所述終止密碼子之后；限制性酶切位點，所述限制性酶切位點位于所述sv40-3UTR之后。本專利技術中，所述“之前”是指位于目標序列的上游5’端，所述“之后”是指位于目標序列的下游3’端。該質粒DNA各元件示意圖如圖1所示，質粒DNA的完整圖譜如圖2所示。根據本專利技術，優選地，所述限制性酶切位點為XbaI酶切位點。根據本專利技術，將sv40-nls入核信號(其氨基酸序列為：Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val，SEQIDNO：3)加到cas9CDS的兩側(ATG后面和終止密碼子前面)。兩端同時放入入核信號，增加了cas9蛋白對細胞核的通過性，可以更加有效地進行基因組基因編輯。在起始密碼子ATG的前面添加Kozak序列“GCCACC”，增加cas9在果蠅體內的表達水平。T7啟動子對cas9DNA序列進行體外轉錄，具有更高的轉錄效率，可以在相同條件下比sp6等其他的啟動子得到產量更高的cas9mRNA。終止密碼子后面添加sv403UTR作為cas9mRNA的3UTR，比傳統加polyA的方法節省了轉錄合成mRNA成本和時間，同時，sv40-3UTR作為果蠅基因表達常用的3UTR，可以增加cas9mRNA在果蠅體內的穩定性，對表達cas9蛋白起到促進作用。通過對cas9轉錄模板DNA序列的各方面的優化，提高了cas9-mRNA在果蠅體內內源表達的效率，從而提高了對果蠅基因組基因編輯的效率。根據本專利技術，采用具有上述元件的質粒DNA即可實現提高cas9-mRNA在果蠅體內內源表達的效率，很顯然地，該質粒DNA可以含有其他不影響上述元件功能或能夠輔助上述元件的其他DNA序列，例如，位于T7啟動子和Kozak序列之間的片段，此類DNA序列的總長度不超過100nt。根據本專利技術一種優選實施方式，所述cas9轉錄模板DNA僅包括上述功能元件，不含有其他功能元件。最優選地，所述cas9轉錄模板DNA具有如SEQIDNO：2所示的堿基序列。本專利技術的第三方面提供上述cas9轉錄模板DNA和上述質粒DNA中至少一種的應用。所述應用例如作為基因編輯工具。具體地，本專利技術還提供一種cas9mRNA體外轉錄方法，該方法包括：(1)將上述質粒DNA進行擴增和酶切線性化，并將得到的線性化模板進行純化；(2)將步驟(1)得到的純化后的模板進行體外轉錄和純化。該方法中，上述擴增和酶切線性化均可采用常規分子生物學方法。步驟(1)中，所述純化的步驟優選包括：采用蛋白酶K加SDS將酶切體系的內切酶去除，然后通過乙醇沉淀。該純化方法簡便、得率高，純度也很高。根據本專利技術，所述體外轉錄也可采用常規分子生物學方法，以及采用常規商購體外轉錄試劑。優選地，所述體外轉錄中GTP的用量為20-50mM時，能夠大大提高轉錄的效率，提高cas9mRNA的產量。根據本專利技術，該方法還包括：對cas9mRNA的濃度進行檢測，所述檢測方法為電泳比對法。即，即將合成好的mRNA稀釋不等的倍數，與DNA標準一起電泳，根據條帶的亮度確定cas9mRNA的實際濃度。本專利技術圍繞CRISPR/Cas9技術在模式動物果蠅中的應用，提供了一種優化的Cas9的表達載體，顯著地提高了基因編輯效率。也為其在其他領域的應用奠定了基礎。此外，本專利技術還提供cas9mRNA體外轉錄方法，該方法具有以下優點：(1)采用蛋白酶K加SDS的純化方法，簡便、得率高，純度也很高。(2)增加了轉錄體系中GTP的用量，大大提高轉錄的效率，提高cas9mRNA的產量。(3)傳統的方法需要對轉錄完成的cas9mRNA進行polyA加尾，由于已經提前引入了sv40-3UTR，所以不需要加尾，簡化了實驗流程。(4)現有技術中采用nanodrop檢測核酸濃度的方法，由于轉錄完成的體系中有大量dNTP的干擾，導致測量濃度比實際濃度過高，如果按照nanodrop測量濃度來配制果蠅注射樣品，會導致樣品中cas9mRNA的量過少，大大影響轉基因效率；本專利技術采用電泳比對法來測定Cas9mRNA的濃度，該方法確定的濃度更準確，進而提高轉基因效率。本專利技術結合了對Cas9的轉錄模板DNA、表達本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于果蠅CRISPR轉基因的cas9轉錄模板DNA，其特征在于，該cas9轉錄模板DNA具有如SEQ?ID?NO：1所示的堿基序列。
【技術特征摘要】
1.一種用于果蠅CRISPR轉基因的cas9轉錄模板DNA，其特征在于，該cas9轉錄模板DNA具有如SEQIDNO：1所示的堿基序列。2.一種用于果蠅CRISPR轉基因的質粒DNA，其特征在于，該質粒DNA包括以下元件：cas9轉錄基因，所述cas9轉錄基因具有如SEQIDNO：1所示的堿基序列；第一40-nls入核信號，位于所述cas9轉錄基因起始密碼子ATG之后，cas9轉錄基因之前；第二40-nls入核信號，位于所述cas9轉錄基因中止密碼子之前，cas9轉錄基因之后；Kozak序列，所述Kozak序列位于所述起始密碼子ATG之前；T7啟動子；sv40-3UTR，所述sv40-3UTR位于所述終止密碼子之后；限制性酶切位點，所述限制性酶切位點位于所述sv40-3UTR之后。3.根據權利要求2所述的用于果蠅CRISPR轉基因的質粒DNA，其中，所述限制性酶切位點為...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張力，李政，
申請(專利權)人：張力，李政，
類型：發明
國別省市：北京,11
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