用于甜瓜單倍體培養未授粉子房的保存及恢復培養方法技術

本發明專利技術公開了一種用于甜瓜單倍體培養未授粉子房的保存及恢復培養，包括：取未授粉子房進行4℃暗處理2d，消毒滅菌后放入0.4 mol/L的蔗糖溶液中，室溫暗處理1d，用3%海藻酸鈉3min和0.1mol/L氯化鈣固定10min，再用加載液處理20min，在4℃的PVS2玻璃液處理30min，放入液氮中保存；迅速取出放入卸載液中水浴解凍，室溫后沖洗、晾干，接入誘導培養基中，接種好的材料先在黑暗條件下34℃熱擊3d，之后放入16/8h光照，在光強為1500～2000lx和25℃的培養室中進行培養。本發明專利技術有效延長了未授粉子房的取樣時長，解決了材料供應不足的問題，保存后恢復培養率可高達80%以上，加速了甜瓜單倍體培養的進程。

Preservation and restoration of unpollinated ovary in haploid culture of Muskmelon

【技術實現步驟摘要】
用于甜瓜單倍體培養未授粉子房的保存及恢復培養方法
本專利技術屬于植物組織培養
，具體地說，涉及一種用于甜瓜未授粉子房離體培養獲得單倍體植株的材料保存方法。
技術介紹
甜瓜（CucumismeloL.）又稱香瓜、哈密瓜等，是葫蘆科屬一年生蔓性草本植物，也是世界十大公認的健康水果之一，含有豐富的營養和藥用價值。中國是世界上甜瓜的生產和消費大國，其產量占世界總產量的50%左右，隨農業結構的調整，甜瓜產業已成為部分地區農民脫貧致富的支柱產業，市場前景廣闊。但我國甜瓜優異種質資源創新較慢，育種水平相對滯后，品種類型無法完全滿足市場需求。因此，創新優異甜瓜資源，提高育種水平，對增強甜瓜產業國際競爭力具有重要意義。在葫蘆科作物上，通過未授粉子房或胚珠為外植體的離體雌核培養獲得單倍體植株是創新種質資源的重要手段，單倍體育種技術也越來越受育種工作者的親睞。目前，甜瓜離體雌核培養獲得單倍體技術還處于初級階段，并未獲得較嫻熟的技術，因為在其誘導培養單倍體的過程中，受材料基因型、取材時間、培養條件諸多因素的影響，其中材料是最主要因素之一。材料的獲取受生長季節的限制比較大，取材的要求嚴格，一般在秋季取樣，在開花前一天上午的9點到11點取樣效果最佳。試驗材料只能在當季節生長期內獲取，一次采取量大，不能及時使用完所取材料，造成材料的浪費；而在甜瓜非季節內無法獲取材料，影響工作的進程。因此，在甜瓜生長季節內，大量取材并進行保存起來，之后，隨取隨用，可克服上述弊端，加速甜瓜單倍體的培養進程。保存材料的目的是使細胞的分裂與生理代謝幾乎處于停滯，使其生命期延長，并且能最大程度上保持被保存材料的遺傳穩定性。目前對植物莖尖，馬鈴薯塊根，花藥，愈傷組織，種子等等的保存技術比較多，且技術成熟。但對甜瓜未授粉子房材料的保存尚未見報道，本專利技術采用了包埋法和玻璃化法巧妙融合，在低溫條件下對未授粉子房進行保存，使材料損傷率極大限度的降低，并且保持其活性，以期能夠加速甜瓜單倍體育種進程，為我國甜瓜種質資源創新、新品種選育、基因工程相關研究提供幫助。
技術實現思路
針對現有甜瓜單倍體培養過程中，未授粉子房材料受生產季節限制的缺點，本專利技術所要解決的技術問題是提供一種甜瓜未授粉子房材料的保存及恢復培養方法，包括：甜瓜未授粉子房的取樣、低溫保存、預處理及保存后的恢復培養。本專利技術為解決技術問題所采取的技術方案是：一種用于甜瓜單倍體培養未授粉子房的保存方法，1、第一步：取材取甜瓜子房長勢健壯的材料，最佳的取材季節是秋季，最佳的取材時間是上午9：00—11：00，最佳的取材時期是在開花的前一天；2、第二步：材料預處理取回來的材料在黑暗條件下4℃處理2d；3、第三步：接種前材料處理把材料用流水沖洗1h，然后去除表面絨毛，接著在超凈工作臺上用70%乙醇消毒30s，再接著用無菌水清洗2遍，用0.2%NaClO2，滅菌10min，最后用無菌水沖洗3-5遍，控水，準備接入培養基中；4、第四步：材料包埋的方式在超凈工作臺上，把材料切成3種不同的形式進行包埋，把整個子房直接包埋；把子房橫切成段包埋；把子房縱切成塊包埋；5、第五步：材料包埋前的預處理把切割處理好的材料放在0.4mol/L的蔗糖溶液中，室溫暗處理1d；6、第六步：低溫保存程序把經過0.4mol/L蔗糖溶液室溫暗處理1d的材料取出，在超凈工作臺上，先用3%海藻酸鈉處理3min，使材料完全浸沒在3%海藻酸鈉（盡量使海藻酸鈉把材料均勻的包埋一層，避免重復包埋）；再用0.1mol/L氯化鈣固定10mim，晾干；再用加載液處理20min；再用PVS2玻璃化液處理30min；最后用滅菌的鋁箔紙包裹好，放入液氮中保存。所述的加載液由在1/2MS培養基中添加136g/L蔗糖和180g/L甘油制成；所述的PVS2玻璃化液由在MS培養基中添加300ml/L甘油、150ml/L乙二醇、150ml/L二甲基亞砜、136g/L蔗糖制成。通過上述保存方法所保存的未授粉子房恢復培養的方法如下：1、第一步：解凍將材料從液氮中取出后迅速放入卸載液中水浴解凍（38～42℃）；2、第二步：接種材料降至室溫后，用室溫的無菌水沖洗材料表面的卸載液，晾干，然后接入誘導培養基中；3、第三步：培養接種后的材料在34℃黑暗條件下熱擊3d，3d后再放入16/8h光照，在光強為1500～2000lx和25℃的培養室中進行光照培養。所述的卸載液由在MS培養基中添加410g/L蔗糖制成。所述的誘導培養基由在MS培養基中添加0.03mg/L噻苯隆TDZ、0.2mg/L激動素KT、150ml/L椰汁、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂制成。所述的MS培養基和1/2MS培養基的組成成分如下：本專利技術的優點1．本專利技術采用獨特的保存技術，對材料進行長期保存，使材料不受生長期取材的限制，可以隨時取材，為甜瓜未授粉子房離體培養誘導單倍體提供了有利的先決條件，同時也加速了甜瓜單倍育種的進程。2．目前沒有關于甜瓜子房低溫保存的技術，本方法優先專利技術。3．本專利技術的技術在材料眾云-18和錦繡上使用后的存活率可分別達80.8%、82.4%，與未經低溫處理保存的存活率無顯著差異。4．本專利技術的方法操作簡單，成本低，保存效果好，保存的遺傳性狀相對穩定，且所得胚狀體的生長狀況良好。5．利用該技術保存甜瓜未授粉子房具有占用空間小，保存數量多，可以隨時培養的特點。附圖說明圖1為本專利技術實施例中采集到的甜瓜未授粉子房的照片；圖2本專利技術實施例中甜瓜子房包埋后保存培養的照片；圖3本專利技術實施例中甜瓜子房低溫保存后恢復培養的照片；圖4本專利技術實施例中甜瓜子房低溫保存后恢復培養2周的照片；圖5本專利技術實施例中甜瓜子房低溫保存后恢復培養4周的照片。具體實施方式結合實例對本專利技術的方法進行詳細的描述，有必要指出的是下面實例僅用于對本專利技術進行進一步的說明，不能理解為對本專利技術保護范圍的限制。1.材料與方法1.1試驗材料供試甜瓜品種是眾云-18和錦繡，由河南省農業科學院園藝所西甜瓜課題室提供。試驗材料于2019年8月1日定植于河南省農業科學院原陽基地的塑料大棚中，9月5日開始出現雌花，在開花的前一天上午9：00-11：00開始取樣。1.2試驗方法1.2.1保存方法1.2.1.1取樣材料的預處理在開花前一天上午9：00-11：00取未授粉的長勢健壯的子房，放冰盒取回，在4℃暗處理2d。1.2.1.2試驗材料接種前的處理經過4℃暗處理2d的材料取出，用流水沖洗1h，清除凈表面污漬。然后在超靜工作臺上操作，輕輕去除表面的絨毛，切勿刮傷子房外表皮，控水。1.2.1.3低溫保存處理把處理好的材料放入超凈工作臺上，先用70%乙本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種用于甜瓜單倍體培養未授粉子房的保存方法，其具體步驟如下：/n（1）于開花前一天的上午取健壯的未授粉子房；/n（2）取回的樣品4℃暗處理2d；/n（3）暗處理后的樣品用流水沖洗1h，去除表面絨毛，70%乙醇消毒30s，接著用無菌水清洗2遍，再用0.2%次氯酸鈉滅菌10min，最后用無菌水沖洗3～5遍，控水，備用；/n（4）將樣品通過不同的形式進行包埋，包埋前的子房放入0.4 mol/L的蔗糖溶液中，室溫暗處理1d；/n（5）用3% 海藻酸鈉處理3min，再放入0.1mol/L 氯化鈣中固定10min；/n（6）用加載液處理20min后，再用4℃的PVS2玻璃液處理30min；/n（7）迅速放入液氮中保存。/n

【技術特征摘要】
1.一種用于甜瓜單倍體培養未授粉子房的保存方法，其具體步驟如下：
（1）于開花前一天的上午取健壯的未授粉子房；
（2）取回的樣品4℃暗處理2d；
（3）暗處理后的樣品用流水沖洗1h，去除表面絨毛，70%乙醇消毒30s，接著用無菌水清洗2遍，再用0.2%次氯酸鈉滅菌10min，最后用無菌水沖洗3～5遍，控水，備用；
（4）將樣品通過不同的形式進行包埋，包埋前的子房放入0.4mol/L的蔗糖溶液中，室溫暗處理1d；
（5）用3%海藻酸鈉處理3min，再放入0.1mol/L氯化鈣中固定10min；
（6）用加載液處理20min后，再用4℃的PVS2玻璃液處理30min；
（7）迅速放入液氮中保存。


2.根據權利要求1所述的用于甜瓜單倍體培養未授粉子房的保存方法，其特征在于：在步驟（4）中，樣品通過3種不同的形式進行包埋，整個子房直接包埋，子房橫切成段包埋，子房縱切成塊包埋。


3.根據權利要求1所述的用于甜瓜單倍體培養未授粉子房的保存方法，其特征在于：在步驟（6）中，所述的加載液由在1/2MS培養基中添加1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙衛星，高寧寧，李海倫，李曉慧，常高正，康利允，梁慎，王慧穎，徐小利，
申請(專利權)人：河南省農業科學院園藝研究所，
類型：發明
國別省市：河南;41