作為趨化因子拮抗劑的氨基端截短的MCP-2制造技術

本發明專利技術涉及以氨基端截短的ＭＣＰ－２，它缺少對應于天然存在的ＭＣＰ－２的氨基酸殘基１、１－２、１－３、１－４或１－５的ＮＨ↓［２］端氨基酸并具有趨化因子拮抗活性，本發明專利技術還涉及編碼這些ＭＣＰ－２的ｃＤＮＡ序列，以及它們在需要有趨化因子作用拮抗活性的疾病治療和／或診斷中的應用，以及包含它們的藥物組合物。（*該技術在2018年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及氨基端截短的MCP-2，它缺少對應于天然存在的MCP-2的氨基酸殘基1、1-2、1-3、1-4或1-5的NH2端氨基酸，并具有趨化因子拮抗活性，本專利技術還涉及編碼這些MCP-2的cDNA序列，以及它們在需要有趨化因子作用拮抗活性的疾病治療和/或診斷中的應用，以及包含它們的藥物組合物。
技術介紹
趨化因子構成了具有白細胞趨化和活化性能的一個促炎性細胞因子小家族。根據第一個半胱氨酸的位置，趨化因子家族可以分為C-C、C-X-C和C-X3-C趨化因子(Baggiolini M.等人，1994；Baggiolini M.等人，1997和Taub D.等人，1996)。許多C-X-C趨化因子，如白細胞介素-8(IL-8)，對于嗜中性粒細胞有趨化作用，而C-C趨化因子，如單核細胞趨化蛋白-3(MCP-3)，則對包括單核細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、NK細胞和樹突細胞在內的各種白細胞有活性。趨化因子的氨基端區域參與受體結合，氨基端的加工可以激活趨化因子或使趨化因子完全沒有活性。C-X-C趨化因子血小板堿性蛋白只有在除去氨基端的24個殘基后才變成一種嗜中性粒細胞趨化肽(NAP-2)(Walz A.等人，1989和Van Damme J.等人，1990)。IL-8缺失8個氨基端殘基導致趨化活性增強，但是位于所有嗜中性粒細胞趨化性C-X-C趨化因子中第一個Cys前的Glu-Leu-Arg基序進一步斷裂卻導致其完全失去活性(Clark-Lewis I.等人，1991)。另一個C-X-C趨化因子粒細胞趨化蛋白-2(GCP-2)發生相似的氨基端蛋白水解(解離下8個氨基酸)卻對嗜中性粒細胞趨化活性沒有影響(Proost P.等人，1993a)。缺少8到9個氨基端氨基酸的合成的C-C趨化因子MCP-1、MCP-3和RANTES對單核細胞沒有活性，并被用作受體拮抗劑(Gong J.等人，1996；和Gong J.等人，1995)。RANTES延伸一個甲硫氨酸將導致該分子完全失去活性，Met-RANTES表現為真正的RANTES拮抗劑(Proudfoot A.E.等人，1996)。已經用cDNA探針(從刺激的針對休眠的外周血淋巴細胞(PBL)衍生獲得)通過差示實驗室篩選分離出人MCP-2(單核細胞引誘蛋白-2)的克隆(它最初稱為“HC14”，Chang H.C.等人，1989)。cDNA衍生的蛋白序列與純化的天然MCP-2相同；然而，還分離出推定的等位基因變體(其中Gln46代替Lys46)(Van Coillie等人，1997)。還用固相化學方法合成了MCP-2(Proost P.等人，1995)。專利技術描述本專利技術的主要目的是氨基端截短的MCP-2，它缺少對應于天然存在的MCP-2的氨基酸殘基1、1-2、1-3、1-4或1-5的氨基端氨基酸，并具有趨化因子拮抗劑活性。更具體地說，本專利技術的一個目的是MCP-2(6-76)，它是缺少氨基端氨基酸1-5的MCP-2，如附圖說明圖1和SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示。本專利技術的這種氨基端截短的MCP-2可以是糖基化形式或非糖基化形式。術語“趨化因子拮抗劑”指“成熟的、天然存在的全長趨化因子的拮抗劑”。本專利技術的另一個目的是包含編碼本專利技術氨基端截短的MCP-2的DNA序列的DNA分子，其中所述DNA序列包括基本上相同的核苷酸序列。“基本上相同的核苷酸序列”包括憑借遺傳密碼的簡并性也能編碼出給定氨基酸序列的所有其它核酸序列。本專利技術還包括含有上述DNA的表達載體，轉化了該載體的宿主細胞，以及通過將所述轉化細胞培養在合適培養基中來制備本專利技術這些氨基端截短的MCP-2的方法。編碼本專利技術蛋白的DNA序列可以插入合適的質粒并與其連接。一旦形成表達載體，就將其導入合適的宿主細胞，該宿主細胞進而表達載體，產生所需蛋白。本文提到的任何本專利技術重組蛋白的表達均可用合適的表達載體在真核細胞(如酵母、昆蟲或哺乳動物細胞)或原核細胞中進行。本領域中已知的任何方法均可采用。例如，用本領域熟知的技術(參見Sambrook等人，1989)將上述任一方法獲得的編碼蛋白的DNA分子插入適當構建的表達載體中。利用同聚物加尾、采用合成的DNA接頭的限制性連接或平頭連接技術，將雙鏈cDNA連接到質粒載體中。用DNA連接酶連接DNA分子，通過堿性磷酸酶處理避免不希望發生的連接。為了能表達所需的蛋白，表達載體還應包含特異的含有轉錄和翻譯調控信息的核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼所需蛋白的DNA連接，從而允許該基因表達和產生蛋白。首先，為了使基因被轉錄，它的前面必須有能被RNA聚合酶識別的啟動子，該啟動子與聚合酶結合，從而啟動轉錄過程?？梢圆捎镁哂胁煌ぷ餍实母鞣N啟動子(強的和弱的啟動子)。對于真核宿主，可以采用不同的轉錄和翻譯調控序列，這取決于宿主的性質。它們可以來自病毒，如腺病毒、牛乳頭瘤病毒、猿猴病毒等，其中調控信號與具有高表達水平的特定基因相關聯。例子是皰疹病毒的TK啟動子、SV40早期啟動子、酵母gal4基因啟動子等?？梢赃x擇轉錄起始調控信號，使其具有阻遏和激活作用，從而能夠調節基因的表達。將包含編碼本專利技術蛋白的核苷酸序列的DNA分子插入載體中與轉錄和翻譯調控信號操作性相連，該載體能將所需基因序列整合入宿主細胞中。還可以通過導入一個或多個允許選擇含有表達載體的宿主細胞的標記物，來選擇被導入的DNA穩定轉化的細胞。標記物還可為營養缺陷型宿主提供光營養、殺微生物的抗性，例如抗生素，或重金屬如銅等?？蛇x擇的標記基因可以和待表達的DNA基因序列直接連接，或通過共轉染導入同一細胞中。為了使本專利技術蛋白的合成最優，可能還需要額外的元件。選擇特定質?；虿《据d體的重要因素包括從不含載體的受體細胞中識別和選出含有載體的受體細胞的容易程度；特定宿主中所希望的載體拷貝數；以及是否希望載體能在不同種宿主細胞之間“穿梭”。一旦制得了用于表達的載體或含DNA序列的構建物，就可用以下多種合適的方法將該DNA構建物導入合適的宿主細胞中轉化、轉染、偶聯、原生質體融合、電穿孔、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等。宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。較佳的是真核宿主，例如哺乳動物細胞，如人、猴、小鼠和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，因為它們為蛋白質分子提供了翻譯后的修飾，包括正確折疊或在正確位點的糖基化。酵母細胞也可進行包括糖基化的翻譯后肽修飾。有許多重組DNA策略采用了強啟動子序列和高拷貝數的質粒，它們可用來在酵母中產生所需的蛋白質。酵母識別克隆的哺乳動物基因產物上的前導序列，并分泌攜帶前導序列的肽(即前肽(pre-peptide))。在導入載體后，使宿主細胞在選擇性培養基中生長，該培養基使含有載體的細胞選擇性地生長。克隆的基因序列的表達導致產生所需的蛋白質。本專利技術的氨基端截短的MCP-2可用本領域中其它熟知的方法來制備，尤其是已建立的化學合成方法用自動化固相肽合成儀，然后進行層析純化。例如，本專利技術的趨化因子可用Fmoc(9-芴甲氧基羰基)、tBoc(叔丁氧羰基)或其它任何類似的化學合成在不同氨基酸上有或沒有合適的側鏈保護基團的條件下合成。有或沒有合適的側鏈保護基團的氨基酸被預先激活(例如用HBTU/HOBt[2-(1H-苯并三唑-1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種氨基端截短的ＭＣＰ－２，它缺少對應于天然存在的ＭＣＰ－２的氨基酸殘基１、１－２、１－３、１－４或１－５的氨基端氨基酸，并具有趨化因子拮抗活性。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：P皮奧斯特，S斯特勒伊夫，J范達默，
申請(專利權)人：應用研究系統ARS股份公司，
類型：發明
國別省市：AN[]