一種通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法技術

本發明專利技術公開了一種通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法。本發明專利技術提供的一種通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法，利用未成熟的白木通種子為外植體進行誘導體細胞胚，主要有以下優點：1）未成熟種子的合子胚具有較高的細胞全能性，比較容易誘導體細胞胚胎發生過程，其次未成熟種子在果肉中處于一種相對無菌環境，組培染菌率低；2）誘導體細胞胚胎發生起始過程以及繼代增殖均不需要添加任何外源植物激素，在MS培養基中便可進行起始誘導和繼代增殖；3）通過體細胞胚胎發生途徑，體細胞胚增殖效率高，在短時間內可獲得大量白木通無菌苗；4）誘導出的體細胞胚能發育成完整的植株，體細胞胚為單細胞起源，具有嵌合率低、變異率低等優勢。

【技術實現步驟摘要】
一種通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法
本專利技術屬于白木通組織培養領域，具體涉及一種通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法。
技術介紹
白木通（Akebiatrifoliatassp.australis）為木通科（Lardizabalaceae）木通屬（Akebia）的多年生木質藤本植物。我國是白木通的分布中心，其分布范圍十分廣泛，北至陜西、山西、河南，南至云南、廣東、廣西。其果實通常在農歷八月成熟，成熟時果皮沿腹線裂開，因此也被成為“八月瓜”、“八月炸”，又因其形似野生香蕉，也被稱為“野香蕉”等。白木通果實不僅美味多汁、香甜可口，還含有豐富的可溶性糖、淀粉、粗蛋白、粗纖維、Vc、礦物質以及17種氨基酸等營養元素（李麗等，2010）。白木通作為傳統中藥材在我國已有兩千多年的應用歷史，其根、莖、葉、果均可入藥，具有消炎利尿、除濕鎮痛、通經下乳等功效。目前白木通已經作為一種藥食兩用的新型水果進行了綜合開發利用，市場對于白木通優良種苗的規?；a提出了巨大需求，而目前白木通種苗多來自野生資源，種苗品質參差不齊，難以滿足市場需求。在白木通優良種苗生產中可以利用扦插法，但存在成活率低，生根困難，生產受季節影響大等問題，因此通過組織培養是進行種苗規?；a以及獲得脫毒苗的重要途徑。申請號為“CN201510334457.0”的專利申請公開了一種白木通快速繁殖的方法，將白木通帶芽莖段進行消毒處理后，轉入培養基中誘導腋芽，將誘導出的腋芽切下并轉移到增殖培養基中，獲得的健壯增殖腋芽接種到生根培養基中進行誘導生根，將獲得的幼苗進行煉苗并移栽。該方法主要包括外植體的消毒、初代培養、增殖培養、生根培養及煉苗移栽等環節，該體系利用白木通帶芽莖段為外植體存在脫毒率低，存在易褐化，增殖效率低等問題。體細胞胚胎發生（somaticembryogenesis，SE）是植物體細胞再生雙極結構并發育成體細胞胚的過程，是一種植物重要的再生途徑。在植物組織培養中，通過愈傷組織誘導幼苗通常需要三到四步來誘導產生芽和根，而體細胞胚胎發生的體外誘導可以通過體細胞直接誘導成幼苗，因此體細胞胚胎發生途徑是一種簡單便捷，快速高效的途徑。然而通過體細胞胚胎發生途徑誘導幼苗因物種不同而有較大差異，許多植物通過該途徑誘導不出幼苗或者效果較差，目前關于白木通通過體細胞胚胎發生途徑誘導幼苗還未見相關報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了解決現有白木通組培技術的染菌率高，增殖效率低等問題，提供一種簡單高效的獲得白木通無菌苗的方法。本專利技術通過以下技術方案解決上述技術問題，一種通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法，其步驟包括，（1）摘取7-8月份未成熟的白木通果實，經處理，從果肉中取出未成熟的種子；（2）將未成熟種子沿背腹線縱切成半，將種子切面朝上放置于MS固體培養基中進行誘導體細胞胚胎發生，獲得誘導體細胞胚；（3）將誘導出的體細胞胚轉移至MS固體培養基中進行繼代增殖培養，獲得增殖體細胞胚；（4）將增殖體細胞胚轉移至成苗培養基中誘導成苗；（5）將獲得的幼苗進行煉苗，煉苗后進行移栽，進而獲得白木通再生苗。為了獲得更好的技術效果，步驟（1）中，所述處理包括果實處理和種子處理；為了獲得更好的技術效果，所述果實處理包括采集表面無病斑未成熟的白木通果實，用毛刷將果實表面污漬刷凈并將其放入洗潔精溶液中浸泡20min，然后用蒸餾水沖洗3-5次，再用濾紙將果實表面水分吸干，之后將表面清洗后的果實放入超凈工作臺，取出果實中未成熟的種子；為了獲得更好的技術效果，所述種子處理包括將取出的種子用無菌水沖洗3-5次，隨后用75%的酒精浸泡30s，再用無菌水沖洗2-3次，接著用0.1%（w/v）HgCl2溶液浸泡7min，再用無菌水沖洗3次，最后將種子用無菌濾紙將表面水分吸干后備用；為了獲得更好的技術效果，步驟（2）中，所述誘導具體為在MS培養基中添加7.0g/L的瓊脂和30.0g/L的蔗糖，控制pH值5.8-6.0，以每個培養基放置6粒種子為一組，誘導時間40天，誘導溫度25±2℃，光照時間12h，光照強度為1500lx，誘導體細胞胚胎發生，獲得誘導體細胞胚，每組重復10次；為了獲得更好的技術效果，步驟（3）中，所述繼代增殖培養包括將起始產生的處于子葉期的體細胞胚從合子胚上分離出來，放置于MS培養基中進行繼代培養至少三輪，每輪產生的體細胞胚用于下一輪的體細胞胚繼代培養，MS培養基中添加7.0g/L的瓊脂和30.0g/L的蔗糖，控制pH值5.8-6.0；為了獲得更好的技術效果，步驟（4）中，所述成苗培養基為1/2MS+0.5mg/L6-BA+7.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖，pH值為5.8-6.0；為了獲得更好的技術效果，步驟（5）中，所述煉苗為將子葉和根系發育良好的幼苗轉移至穴盤中，在溫室大棚放置2個月進行煉苗，溫度在30±3度，濕度在75±5；為了獲得更好的技術效果，所述穴盤的組成為重量比河沙：有機肥=3:1的混合物。本專利技術提供的一種通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法，利用未成熟的白木通種子為外植體進行誘導體細胞胚，主要有以下優點：1）未成熟種子的合子胚具有較高的細胞全能性，比較容易誘導體細胞胚胎發生過程，其次未成熟種子在果肉中處于一種相對無菌環境，組培染菌率低；2）誘導體細胞胚胎發生起始過程以及繼代增殖均不需要添加任何外源植物激素，在MS培養基中便可進行起始誘導和繼代增殖，簡單便捷；3）通過體細胞胚胎發生途徑，體細胞胚增殖效率高，在短時間內可獲得大量白木通無菌苗；4）誘導出的體細胞胚能發育成完整的植株，不需要經過愈傷階段、誘導生根階段；體細胞胚為單細胞起源，具有嵌合率低、變異率低等優勢。附圖說明圖1為本專利技術白木通未成熟的種子照片；圖2為本專利技術未成熟種子接種一周的照片；圖3為本專利技術未成熟種子誘導出體細胞胚的照片；圖4為本專利技術體細胞胚繼代培養初期的照片；圖5為本專利技術體細胞胚繼代培養2周后的照片；圖6為本專利技術三輪繼代培養后得到的無菌苗照片。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本專利技術作進一步的詳細說明。實施例1一種通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法，其步驟包括，步驟（1）摘取7-8月份未成熟的白木通果實，經處理用解剖刀從果肉中取出未成熟的種子，所述處理包括果實處理和種子處理；（1.1）果實處理：在7-8月份，采集表面無病斑未成熟的白木通果實，用毛刷將果實表面污漬刷凈并將其放入洗潔精溶液中浸泡20min，然后用蒸餾水沖洗3-5次，再用濾紙將果實表面水分吸干；之后將表面清洗后的果實放入超凈工作臺，用解剖刀和解剖針取出果實中未成熟的種子；（1.2）種子處理：將取出的種子用無菌水沖洗3-5次，隨后用75%的酒精浸泡30s，再用無菌水沖洗2-3次，接著用0.1%（w/v）HgCl2溶本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法，其步驟包括，/n（1）摘取7-8月份未成熟的白木通果實，經處理，從果肉中取出未成熟的種子；/n（2）將未成熟種子沿背腹線縱切成半，將種子切面朝上放置于MS固體培養基中進行誘導體細胞胚胎發生，獲得誘導體細胞胚；/n（3）將誘導出的體細胞胚轉移至MS固體培養基中進行繼代增殖培養，獲得增殖體細胞胚；/n（4）將增殖體細胞胚轉移至成苗培養基中誘導成苗；/n（5）將獲得的幼苗進行煉苗，煉苗后進行移栽，進而獲得白木通再生苗。/n

【技術特征摘要】
1.一種通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法，其步驟包括，
（1）摘取7-8月份未成熟的白木通果實，經處理，從果肉中取出未成熟的種子；
（2）將未成熟種子沿背腹線縱切成半，將種子切面朝上放置于MS固體培養基中進行誘導體細胞胚胎發生，獲得誘導體細胞胚；
（3）將誘導出的體細胞胚轉移至MS固體培養基中進行繼代增殖培養，獲得增殖體細胞胚；
（4）將增殖體細胞胚轉移至成苗培養基中誘導成苗；
（5）將獲得的幼苗進行煉苗，煉苗后進行移栽，進而獲得白木通再生苗。


2.如權利要求1所述通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法，其特征在于，步驟（1）中，所述處理包括果實處理和種子處理。


3.如權利要求2所述通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法，其特征在于，所述果實處理包括采集表面無病斑未成熟的白木通果實，用毛刷將果實表面污漬刷凈并將其放入洗潔精溶液中浸泡20min，然后用蒸餾水沖洗3-5次，再用濾紙將果實表面水分吸干，之后將表面清洗后的果實放入超凈工作臺，取出果實中未成熟的種子。


4.如權利要求2所述通過體細胞胚胎發生途徑快速繁殖白木通幼苗的方法，其特征在于，所述種子處理包括將取出的種子用無菌水沖洗3-5次，隨后用75%的酒精浸泡30s，再用無菌水沖洗2-3次，接著用0.1w/v%HgCl2溶液浸泡7min，再用無菌水沖洗3次，最后將種子用無菌濾紙將表面水分吸干后備用。


5.如權利要...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄒帥宇，黃宏文，高浦新，賈天嬌，丁劍敏，范思慶，
申請(專利權)人：江西省中國科學院廬山植物園，
類型：發明
國別省市：江西;36