一種外泌體及其制備方法及應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種外泌體的制備方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，包括以下步驟：將人星型膠質(zhì)細(xì)胞置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)；利用超聲裝置對(duì)人星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)刺激；將經(jīng)超聲循環(huán)刺激后的人星型膠質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清離心處理得到外泌體。還提供上述制備方法獲得的外泌體及應(yīng)用。上述制備方法操作簡單、成本較低且可控性強(qiáng)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種外泌體及其制備方法及應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及生物
，具體而言，涉及一種無創(chuàng)超聲處理細(xì)胞在制備外泌體中的應(yīng)用、外泌體及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
阿爾茨海默癥(Alzheimer’disease，AD)，又叫老年癡呆癥，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，起病隱襲，病程呈慢性進(jìn)行性，該疾病也是最常見的引起癡呆的原因，約占癡呆總數(shù)的60-80％。其主要病理特征包括β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)組成的老年斑和過度磷酸化的微管結(jié)合蛋白tau組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles，NFT)。到目前為止，目前針對(duì)阿爾茨海默癥的治療藥物僅僅只能在病情發(fā)展的特定階段緩解部分癥狀，并不能減緩、治愈阿爾茨海默癥。因此，發(fā)展針對(duì)阿爾茨海默癥病因的治療手段，是急需解決的重要問題。外泌體(exosomes)是由脂質(zhì)雙分子層包裹形成的類圓形膜性小體，是胞外囊泡的一種類型，內(nèi)含多種蛋白質(zhì)、RNA、miRNA、生長因子及其受體等。外泌體可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外圍循環(huán)之間進(jìn)行傳播1。多種神經(jīng)退行性疾病都有蛋白的異常積累和聚集2，神經(jīng)元核內(nèi)體和溶酶體中富余物質(zhì)的積累，是阿爾茨海默病中導(dǎo)致神經(jīng)脆弱的重要因素。細(xì)胞外囊泡(EVs)(外泌體和微泡)形成內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)參與生物分子(蛋白質(zhì)和RNA)在細(xì)胞之間交換。這使得EVs具有巨大的藥物輸送和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的潛力。目前制備外泌體的方法過程復(fù)雜，可控性差且成本較高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)主要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、成本較低且可控性強(qiáng)的外泌體及其制備方法及應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)采用的一個(gè)技術(shù)方案是：一種外泌體的制備方法，包括以下步驟：將人星型膠質(zhì)細(xì)胞置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)；利用超聲裝置對(duì)人星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)刺激；將經(jīng)超聲循環(huán)刺激后的人星型膠質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清離心處理得到外泌體。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述循環(huán)刺激條件為:超聲裝置的探頭頻率為0.5-5MHz，幅值為50-000mV，脈沖重復(fù)頻率為50-1000Hz，工作周期為10％-70％，超聲裝置的功率放大器放大5％-45％，循環(huán)20-200k次，脈沖間隔為2μs-2s，超聲時(shí)間為1分鐘-10分鐘。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基為不含外泌體的高糖DMEM。在其中一個(gè)實(shí)施例中，將經(jīng)超聲循環(huán)刺激后的人星型膠質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)采用的一個(gè)技術(shù)方案是提供上述制備方法獲得的外泌體。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述外泌體的平均直徑約為50nm～150nm。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)采用的一個(gè)技術(shù)方案是將上述制備方法制備得到的外泌體在制備預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)采用的一個(gè)技術(shù)方案是將上述制備方法制備得到的外泌體在用于降解β-淀粉樣蛋白中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的有益效果是：相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)利用醫(yī)學(xué)超聲技術(shù)，通過不同的強(qiáng)度、頻率、脈沖重復(fù)頻率、脈沖寬度、持續(xù)時(shí)間使刺激部位的中樞神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定、防御和再生的基礎(chǔ)。星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和功能可以通過環(huán)境刺激或藥物來調(diào)節(jié)。本專利技術(shù)利用超聲波刺激人星型膠質(zhì)細(xì)胞，分離得到的外泌體的制備方法過程簡單，操作方便，可控性強(qiáng)，成本低。得到的外泌體可以減緩甚至逆轉(zhuǎn)β-淀粉樣蛋白(Aβ)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性，在小鼠體內(nèi)減少Aβ斑塊在大腦的沉積，可以應(yīng)用于新型治療阿爾茨海默癥藥物中。附圖說明圖1是一實(shí)施方式的未經(jīng)過超聲刺激的星型膠質(zhì)細(xì)胞外泌體的透射電鏡圖；圖2為超聲刺激的星型膠質(zhì)細(xì)胞外泌體示意圖；圖3為一實(shí)施方式的未經(jīng)過超聲刺激的星型膠質(zhì)細(xì)胞外泌體的納米顆粒追蹤分析(NTA)結(jié)果示意圖；圖4為一實(shí)施方式的超聲刺激的星型膠質(zhì)細(xì)胞外泌體的納米顆粒追蹤分析(NTA)結(jié)果示意圖；圖5為一實(shí)施方式的未經(jīng)過超聲刺激的星型膠質(zhì)細(xì)胞外泌體和超聲刺激的星型膠質(zhì)細(xì)胞外泌體的外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)heatmap圖；圖6為一實(shí)施方式的超聲刺激的星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體cck-8結(jié)果示意圖；圖7為一實(shí)施方式的超聲刺激的星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)APP/PSI轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默癥小鼠的體內(nèi)治療作用效果示意圖，其中，A圖示中采用硫黃素S染色法檢測Aβ斑塊沉積，綠色為斑塊，藍(lán)色為細(xì)胞核。B圖示中β1-42抗體免疫熒光染色檢測Aβ1-42在腦內(nèi)的分布，綠色為Aβ，藍(lán)色為細(xì)胞核；其他圖示解釋：HA-EXO表示星型膠質(zhì)細(xì)胞外泌體，US-HA-EXO表示超聲刺激的星型膠質(zhì)細(xì)胞外泌體。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本專利技術(shù)，而不應(yīng)視為限制本專利技術(shù)的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。一種外泌體的制備方法，包括以下步驟：S110、將人星型膠質(zhì)細(xì)胞置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。具體地，培養(yǎng)基為不含外泌體的高糖DMEM。在一實(shí)施方式中，將人星型膠質(zhì)細(xì)胞(HA)細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入不含外泌體的高糖DMEM培養(yǎng)基，等細(xì)胞在37°培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后利用超聲裝置對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行刺激。總的時(shí)間持續(xù)5分鐘。刺激結(jié)束后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)良好，與未刺激細(xì)胞無差異。S120、利用超聲裝置對(duì)人星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)刺激；具體地，在一實(shí)施方式中，循環(huán)刺激條件為:超聲裝置的探頭頻率為0.5-5MHz，幅值為50-000mV，脈沖重復(fù)頻率為50-1000Hz，工作周期為10％-70％，超聲裝置的功率放大器放大5％-45％，循環(huán)20-200k次，脈沖間隔為2μs-2s，超聲時(shí)間為1分鐘-10分鐘。循環(huán)超聲可以自主調(diào)節(jié)多個(gè)超聲參數(shù)，有助于超聲參數(shù)的多樣化及對(duì)細(xì)胞的精確刺激。S130、將經(jīng)超聲循環(huán)刺激后的人星型膠質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清離心處理得到外泌體。上述制備方法制備得到的外泌體。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述外泌體的平均直徑約為50nm～150nm，且呈現(xiàn)典型的外泌體粒徑分布情況。上述制備方法制備得到的外泌體在制備預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。上述制備方法制備得到的外泌體在用于降解β-淀粉樣蛋白中的應(yīng)用。實(shí)施例將人星型膠質(zhì)細(xì)胞(HA)細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入不含外泌體的高糖DMEM培養(yǎng)基，等細(xì)胞在37°培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后利用超聲裝置對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行刺激。總的時(shí)間持續(xù)5分鐘。HA細(xì)胞經(jīng)超聲刺激后繼續(xù)置于37°培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行一系列離心處理，400g，離心15分鐘，2000g，離心30分鐘，10000g離心60分鐘，100000g離心90分鐘，獲得的沉淀即為外泌體。參閱圖1和圖2，圖1為未經(jīng)過超聲刺激的星型膠質(zhì)細(xì)胞外泌本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種外泌體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：/n將人星型膠質(zhì)細(xì)胞置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)；/n利用超聲裝置對(duì)人星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)刺激；/n將經(jīng)超聲循環(huán)刺激后的人星型膠質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清離心處理得到外泌體。/n

【技術(shù)特征摘要】
1.一種外泌體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
將人星型膠質(zhì)細(xì)胞置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
利用超聲裝置對(duì)人星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)刺激；
將經(jīng)超聲循環(huán)刺激后的人星型膠質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清離心處理得到外泌體。


2.根據(jù)權(quán)利要求1所述外泌體的制備方法，其特征在于，所述循環(huán)刺激條件為:超聲裝置的探頭頻率為0.5-5MHz，幅值為50-000mV，脈沖重復(fù)頻率為50-1000Hz，工作周期為10％-70％，超聲裝置的功率放大器放大5％-45％，循環(huán)20-200k次，脈沖間隔為2μs-2s，超聲時(shí)間為1分鐘-10分鐘。


3.根據(jù)權(quán)利要求1所述外泌體的制備方法，其特征...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄧志婷，鄭海榮，嚴(yán)飛，肖楊，李飛，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44