本發明專利技術公開了一種L?蘋果酸脫氫酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4，與野生型L?蘋果酸脫氫酶相比，顯著提高了酶活力。該L?蘋果酸脫氫酶突變體能夠通過酶促拆分DL?蘋果酸來生產高光學純度的D?蘋果酸和草酰乙酸。
【技術實現步驟摘要】
一種L-蘋果酸脫氫酶突變體及其應用
本專利技術屬于酶催化
，具體地說，涉及一種L-蘋果酸脫氫酶突變體、及其用于生產D-蘋果酸和草酰乙酸的用途。
技術介紹
蘋果酸，又名2-羥基丁二酸，由于分子中有一個不對稱碳原子，故存在兩種立體異構體L-蘋果酸和D-蘋果酸。天然存在的蘋果酸都是L-型的，幾乎存在于一切果實中，以仁果類中最多，也可由延胡索酸經生物發酵制得。它是人體內部循環的重要中間產物，易被人體吸收，因此作為性能優異的食品添加劑和功能性食品廣泛應用于食品、化妝品、醫療和保健品等領域。DL-蘋果酸可由延胡索酸或馬來酸在催化劑作用下于高溫高壓條件和水蒸氣作用制得。因為人體不易代謝D-蘋果酸，因而不允許DL-蘋果酸作為添加劑。隨著醫藥工業的發展，D-蘋果酸在醫藥工業中有越來越廣泛的用途，例如，D-蘋果酸作為手性前體可用于手性藥物的合成，用作原料合成抗生素、抗病毒藥物、抗組胺藥物等。D-蘋果酸的制備方法主要有化學合成法、外消旋體的物理和化學拆分法、生物法。化學合成及拆分法制備D-蘋果酸成本較高，一直處于研究階段。生物法制備D-蘋果酸主要通過微生物自身誘導表達L-蘋果酸脫氫酶的微生物由馬來酸制備D-蘋果酸；此外，參見CN110747190A，還有大腸桿菌表達L-蘋果酸脫氫酶來全細胞催化制備D-蘋果酸，產物濃度都可以達到200g/L以上，通過微生物自身誘導表達L-蘋果酸脫氫酶的微生物培養條件復雜，微生物生長濃度不高，同時，產物中會含有少量的L-蘋果酸、DL-蘋果酸，蘋果酸二聚體等難以分離的物質，提純比較困難，造成工業化生產成本較高，無法滿足市場需求。采用一種專一高效的L-蘋果酸脫氫酶，以DL-蘋果酸為底物，將其中的L-蘋果酸脫氫轉化成為草酰乙酸，然后分別純化提起D-蘋果酸和草酰乙酸，是一個可供選擇的替代方法。
技術實現思路
為了探索酶促拆分法制備D-蘋果酸的工業化可行性，我們將研究方向關注在L-蘋果酸脫氫酶(MDH，EC1.1.1.37)的利用上，并對于各種來源的L-蘋果酸脫氫酶進行了篩選和比較。L-蘋果酸脫氫酶廣泛存在于自然界的各種生物中，需要以NADP+(少數可以NAD+)為輔因子，可逆地催化L-蘋果酸到草酰乙酸，是三羧酸循環(TCAcycle)的關鍵酶。源于冷海水黃桿菌(FlavobacteriumfrigidimarisKUC-1)的蘋果酸脫氫酶(ffMDH)(SEQIDNO:1)可以特異地催化L-蘋果酸的氧化和草酰乙酸的還原，并能同時以NAD+和NADP+作為輔因子，但ffMDH熱穩定性較差，因此通過定向誘變獲得高酶活性和立體選擇性的突變酶是本專利技術的目標。經過高通量篩選和實驗驗證，最終獲得一些酶活力顯著提高的L-蘋果酸脫氫酶突變體ffMDHmut，通過大腸桿菌過表達密碼子優化的ffMDHmut基因和LreNox基因，再輔以NADH/NADPH氧化酶進行全細胞催化，可高效制備D-蘋果酸和草酰乙酸，有望在工業化生產中得到應用。具體而言，本專利技術包含如下
技術實現思路
。一種L-蘋果酸脫氫酶突變體，其氨基酸序列為：SEQIDNO:3，其為SEQIDNO:1第65位的Y替換為D、第139位的R替換為L、第231位的A替換為V的突變體，其氨基酸序列為：MKVTIVGAGNVGATCADVISYRGIASEVVLLDIKEGFAEGKALDIMQCATNTGFNTKVSGVTNDDSKTAGSDVVVITSGIPRKPGMTREELIGINAGIVKTVAENVLKHSPNTIIVVVSNPMDTMTYLALKATGVPKNLIIGMGGALDSSRFRTYLSLALDKPANDISAMVIGGHGDTTMIPLTRLASYNGIPVTEFLSEEVLQKVAADTMVGGATLTGLLGTSAWYAPGVSVAYLVDSILNDQKKMIACSVFVEGEYGQNDICIGVPCIIGKNGVEEILDIKLNDQEKALFAKSADAVRGMNDALKSILV(SEQIDNO:3)；或者SEQIDNO:4，其為SEQIDNO:1第65位的Y替換為C、第231位的A替換為R的突變體，其氨基酸序列為：MKVTIVGAGNVGATCADVISYRGIASEVVLLDIKEGFAEGKALDIMQCATNTGFNTKVSGVTNDCSKTAGSDVVVITSGIPRKPGMTREELIGINAGIVKTVAENVLKHSPNTIIVVVSNPMDTMTYLALKATGVPKNRIIGMGGALDSSRFRTYLSLALDKPANDISAMVIGGHGDTTMIPLTRLASYNGIPVTEFLSEEVLQKVAADTMVGGATLTGLLGTSAWYAPGRSVAYLVDSILNDQKKMIACSVFVEGEYGQNDICIGVPCIIGKNGVEEILDIKLNDQEKALFAKSADAVRGMNDALKSILV(SEQIDNO:4)。這兩個突變體的共同特征是野生型L-蘋果酸脫氫酶SEQIDNO:1第65位的酪氨酸Y(或Tyr)和第231位的丙氨酸A(或Ala)發生了突變。優選上述L-蘋果酸脫氫酶突變體的氨基酸序列為SEQIDNO:3。本專利技術的第二個方面提供了一種編碼上述L-蘋果酸脫氫酶突變體SEQIDNO:3或者SEQIDNO:4的基因。優選地，編碼上述L-蘋果酸脫氫酶突變體SEQIDNO:3的基因可以是核苷酸序列SEQIDNO:5。本專利技術的第三個方面提供了一種質粒，其包含編碼上述L-蘋果酸脫氫酶突變體的基因。該質粒優選是pET系列載體，比如是pET28a、pET24a或者pET-Duet，但并不受限于此。在一種實施方式中，上述質粒還可以包含NADH氧化酶基因(Nox基因)，使得該質粒能夠共表達L-蘋果酸脫氫酶突變體的基因和NADH氧化酶的基因。優選該質粒載體是pET-Duet，由于pET-Duet含有雙T7啟動子，可同時啟動兩個基因比如L-蘋果酸脫氫酶突變體基因和Nox基因的表達。優選地，所述Nox基因是羅伊氏乳桿菌(LactobacillusreuteriJCM1112)來源的Nox基因(GenBank:AP007281.1)，簡稱為LreNox基因，SEQIDNO:6：atgaaggttattattgttggttgtacacatgcgggaacaattactgccactcaaattttacagaatcatccagaaacagaagtcacaatttatgaacggaatgataacgtttcattcctctcatgtgggattgcagtttacttgagcggtgatgttggtaatccagatgcgatgttttattcaagccctgaacaacttgctgccatgggtgcaacagttcatatgcaacataatgtaactgatattgaccctaagactaagacagtcacagtgacagaccttgtgacaggcgaaacaaagaccgaccattatgataagttagttgatac本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種L-蘋果酸脫氫酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:4。/n
【技術特征摘要】
1.一種L-蘋果酸脫氫酶突變體，其氨基酸序列為SEQIDNO:3或者SEQIDNO:4。
2.編碼如權利要求1所述L-蘋果酸脫氫酶突變體的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于，編碼L-蘋果酸脫氫酶突變體SEQIDNO:3的基因核苷酸序列為SEQIDNO:5。
4.一種質粒，其特征在于，包含如權利要求3所述的基因。
5.如權利要求5所述的質粒，其特征在于，還包含NADH氧化酶基因即Nox基因。
6.轉化了如權利要求4或5...
【專利技術屬性】
技術研發人員：范文超，高書良，丁鵬，
申請(專利權)人：洛陽華榮生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：河南;41
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