用環(huán)狀RNAcircKIF4A與miR-1231序列吸附量來檢測細胞癌變程度制造技術(shù)

環(huán)狀RNA circKIF4A序列與miR

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
GCGTTACTGA
[0010]3901 AAAGAAGGTA ACCTTTGTTG GATGTGGGCC TTAGCCTCCA GGTCCAGACT ACTACTCTAT
[0011]3961 GTTCTCCAGA AGGGTGCTAA GTCACCTACT GAAGAGAGAA CCAACTGACT TTCCTATTGA
[0012]4021 CTCATCAGGA ACCAGTCCTC AGTCTGGTCA AGTTGTTTCT TATTTGTGAG CAGTTCAGGC
[0013]4081 TATCTCCTGA TGGGGATGAG GCCAAGGCTT TCTTATCTTT TGGTTGTCTC TGCTTAATGG
[0014]4141 AGGAGCCTGG CCTAGGATGG AGGCCTGGCT TAGATCTTTC ATTCCACCTC AGGAATGAGG
[0015]4201 TTGTGATCTT TCCTGTCCTG ACCCTCTCTG AATTATGTTT CAATAGTACT CTTGATTGTC
[0016]4261 TGCCATGTTG TTGAAGCAAA TGAATTATTT TTAAATGTTA AGTAAGTAAA TAAACCTTAG
[0017]4321 CCCGTCTACT GTTTGGGAAG ATCCTTCTGT GCTAGAGGGA GAAATAAAAT TTCAACCTGT
[0018]4381 GTTCCTCA
[0019]一種miR
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1231特定序列，其特征在于吸附環(huán)狀RNA circKIF4A特定序列，環(huán)狀RNA circKIF4A特定序列與miR
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1231特定序列見NO.2。如圖3所示。
[0020]預(yù)測吸附位點舉例如下，上方序列為環(huán)狀RNA circKIF4A序列，下方為miR
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1231序列。但是通過生物信息分析，二者通過序列結(jié)合的位點不止此一種方式，還可能有其他序列結(jié)合位點：
[0021]circKIF4A特定序列：UGUUAAUAUUGAUCCCCAGACAG
[0022]miR
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1231特定序列：CGUCGACAGGCGGGUCUGUG
[0023]一種檢測前列腺細胞癌變進程的方法，其特征在于，通過高通量檢測、分析miR
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1231特定序列吸附環(huán)狀RNA circKIF4A序列量，吸附數(shù)量越多則細胞癌變的程度越高。
[0024]所述的circKIF4A的m6A甲基化修飾程度越高，則吸附miR
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1231特定序列越多。我們通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌患者的癌細胞樣本中這段序列的腺嘌呤脫氧核苷酸(A)發(fā)生了甲基化，
[0025]有益效果：通過高通量測序、分析環(huán)狀RNA circKIF4A吸附miR
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1231特定序列或根據(jù)circKIF4A的m6A甲基化修飾程度可以判斷細胞癌變程度，進而可以有效地針對性治療。
附圖說明
[0026]圖1為表觀轉(zhuǎn)錄組調(diào)控層面提示環(huán)狀RNA抑制表達的miRNAs示意圖。
[0027]圖2為轉(zhuǎn)錄本NM_012310.5序列位于染色體位置及堿基序列
[0028]圖3為：環(huán)狀RNA circKIF4A特定序列與miR
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1231序列NO.2舉例
具體實施方式
[0029]原理：通過非編碼RNA高通量測序(illumina Novaseq平臺，雙端測序，PE150)，研究circKIF4A在前列腺癌癌細胞鐵死亡的調(diào)控機制。技術(shù)路線如下：
[0030]1、通過鐵死亡試劑盒，分析circKIF4A和miR
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1231對前列腺癌細胞鐵死亡細胞程序性調(diào)控中樞抑制因子抗氧化酶GPX4的影響。GPX4在癌細胞鐵死亡中的表達和活性依賴于谷胱甘肽和硒的存在。哺乳動物細胞和人細胞中已經(jīng)證明存在以GPX4為核心的抑制細胞鐵死亡的信號通路。
[0031]2、circKIF4A m6A修飾相關(guān)的表觀遺傳因子METTL16，上調(diào)circKIF4A的表達，增加對miR
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1231的吸附，進而影響miR
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1231的靶基因GPX4，上調(diào)鐵死亡中樞抑制因子GPX4的表達，增加前列腺癌細胞鐵死亡抑制作用，進而使前列腺癌超惡性方向發(fā)展。
[0032]具體實施例如下：
[0033](1)篩選Circular RNAs
[0034]通過RNA
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seq高通量測序分析在前列腺癌癌組織中異常表達的circRNAs,在本研究中，根據(jù)生物信息分析選擇circKIF4A
[0035]1.在30對臨床前列腺癌組織及其配對癌旁組織中，進行生物學重復(fù)的全轉(zhuǎn)錄組的RNA
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seq分析(包括circRNAs建庫)，通過RNA
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seq分析篩選出在前列腺癌組織中高表達的circRNAs,通過qPCR在前列腺癌細胞中對篩選到的Circular RNAs進行驗證，通過綜合分析，選擇circKIF4A。
[0036]2.在正常前列腺細胞或多種前列腺癌細胞系中，通過qPCR實驗分析的circKIF4A。表達，尋找兩個circKIF4A表達較高的前列腺癌細胞系，用于后續(xù)分析，在此先以PC3 and C4
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2細胞為例。
[0037]3.分別合成circKIF4A，及其同轉(zhuǎn)錄本的mRNA的PCR引物，在PC3 and C4
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2細胞中，利用qPCR實驗驗證及其同轉(zhuǎn)錄本的mRNA對RNase R和放線菌銅D的敏感性，以分析circKIF4A的穩(wěn)定特性。
[0038]4.在PC3 and C4
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2細胞中，利用qPCR技術(shù)，以GAPDH為內(nèi)參，分析驗證circKIF4A在細胞中的表達。
[0039]5.利用qPCR實驗，在PC3 and C4
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2細胞中，從多個shRNAs中篩選出效率最高的shRNA，用于后續(xù)實驗。
[0040](2)研究circKIF4A對前列腺癌腫瘤細胞鐵死亡的影響
[0041]通過靶向免疫沉淀、鐵死亡試劑盒等細胞生物學、分子生物學和生物化學手段，分析circKIF4A對腫瘤細胞鐵死亡的影響。
[0042]1.在PC3 and C4
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2細胞中，利用circKIF4A shRNAs，通過不同的試劑盒，分析Circular RNA A對iron,lipid ROS,Fe
2+
,MDA,GSH等鐵死亡標志物的影響。
[0043]2.在PC3 and C4
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2細胞中，利用circKIF4A shRNAs，通過Western blot以及免疫熒光實驗，分析circKIF4A對ACSL4、GP本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種環(huán)狀RNA circKIF4A序列，其特征在于，序列轉(zhuǎn)錄本見NM_012310.5。2.一種miR
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1231特定序列，其特征在于吸附權(quán)利要求1中特定的序列，circKIF4A序列與miR
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1231特定序列見NO.2。3.一種檢測前列腺細胞癌變進程的方法，其特征在于，通過高通量測序檢測、生物信息分析環(huán)狀RNA c...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：穆海東，汪寧梅，張文參，
申請(專利權(quán))人：上海裕隆生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：