凝集素-磁性載體偶聯復合物用于分離糖基化外泌體的應用制造技術

本發明專利技術是申請號為202010060055.7的分案申請，本發明專利技術涉及一種用于分離臨床樣本中的糖基化外泌體的凝集素

Application of lectin magnetic carrier coupling complex in the separation of glycosylated exosomes

【技術實現步驟摘要】
凝集素
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磁性載體偶聯復合物用于分離糖基化外泌體的應用
[0001]本專利技術是申請日為2020年01月19日，申請號為202010060055.7，專利技術創造名稱為“一種用于分離臨床樣本中的糖基化外泌體的凝集素
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磁性載體偶聯復合物”的中國申請的分案申請。


[0002]本專利技術屬于生物醫藥及生物分離相關的
，涉及一種用于分離臨床樣本中的糖基化外泌體的凝集素
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磁性載體偶聯復合物、及分離方法。

技術介紹

[0003]外泌體是細胞多泡內體與質膜融合時釋放產生的具有生物活性的微小囊泡，其直徑約為30～150nm，是細胞間通訊的重要介質之一；在人健康的生理情況下，外泌體可以在細胞之間運送DNA、蛋白質、mRNA、miRNA等多種生物活性物質，參與細胞通訊、細胞遷移、腫瘤細胞增長等多種過程，完成細胞間物質及信息的傳遞。文獻研究發現，幾乎所有類型的細胞均會分泌外泌體，并且在血液、唾液、尿液、腦脊液、積液和乳汁等體液中都能夠提取到外泌體。
[0004]外泌體與腫瘤、慢性感染性疾病、自身免疫病等很多疾病相關，當機體發生病變時，細胞分泌的外泌體的成分、含量、性質等都可能發生改變；糖基化外泌體在包括腫瘤在內的多種疾病的發生、發展過程中均有著重要作用，外泌體的檢測研究能有效監測疾病的發生、發展；由于外泌體在臨床樣本中含量比較低，外泌體的分離富集對外泌體的研究至關重要。
[0005]目前，外泌體分離方法很多，主要有：超速離心法或梯度密度離心法，免疫磁珠法等。其中：超速離心法或梯度密度離心法是基于外泌體與其他生物組份密度的微小差異進行分離，該方法需要特殊設備，樣品需求量比較大，耗時長，且因為不同臨床樣本的特點不同，采用該方法的分離效果穩定性差，進一步地超速離心還容易造成囊泡損傷從而影響后續實驗；免疫磁珠法的原理是外泌體表面的特異性蛋白如：CD9/CD63/CD81等與包被有對應抗體的免疫磁珠相結合，進行磁分離，但由于免疫磁珠體積較小，粒徑為納米級別且小于等于外泌體的直徑，因此免疫磁珠與外泌體結合的空間位阻較大，外泌體結合不充分，分離效率不高。此外，免疫磁珠法中應用的洗脫液為酸性洗脫液，容易造成外泌體囊泡破裂、形態不完整，因此，也就無法準確分離出糖基化外泌體，并將其應用于疾病的發生、發展等過程中檢測、監控及診斷。
[0006]因此，一種能快速、精準、自動化高效分離富集臨床樣本中的糖基化外泌體的組合物及方法的研究建立是必須的。

技術實現思路

[0007]針對現有技術的不足，本專利技術提供了一種用于分離臨床樣本中的糖基化外泌體的凝集素
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磁性載體偶聯復合物，本專利技術還提供了一種含有該凝集素
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磁性載體偶聯復合物的
糖基化外泌體分離組合物，以及使用該凝集素
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磁性載體偶聯復合物進行糖基化外泌體分離的方法及應用。本專利技術提供的凝集素
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磁性載體偶聯復合物可以精準分離臨床樣本中的糖基化外泌體，分離效率高，分離后的外泌體形態完整，無破裂或碎裂，可直接用于糖基化外泌體液體檢測，或直接進行免疫學相關檢測，或直接提取外泌體內相關核酸進行基因檢測分析。本專利技術提供的糖基化外泌體分離的方法中，利用外泌體外表面豐富的糖鏈可以和凝集素結合的原理，采用有效地清洗及有效地洗脫方法可以分離糖基化外泌體，并且非常簡便、快速、容易實現自動化，重復性好，分離后的外泌體形態完整，無破裂或碎裂，將其應用于疾病的發生、發展等過程中檢測、監控及診斷。
[0008]本專利技術提供了一種用于分離臨床樣本中的糖基化外泌體的凝集素
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磁性載體偶聯復合物，包括：磁性載體；和偶聯在磁性載體外側的凝集素；其中：
[0009]所述凝集素包括：木菠蘿凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麥胚素、大豆凝集素、蕓豆凝集素、蝸牛凝集素(HAA和/或HPA)中的任意一種或者兩種及以上；
[0010]所述磁性載體包括：葡聚糖磁珠、瓊脂糖磁珠、樹脂或環氧樹脂磁珠、聚苯乙烯磁珠中的任意一種或者兩種及以上。
[0011]上述凝集素
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磁性載體偶聯復合物在某些實施方式中，所述磁性載體粒徑分布范圍為1μm
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200μm，優選為10μm
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200μm，更進一步優選為30μm
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150μm。
[0012]上述凝集素
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磁性載體偶聯復合物在某些實施方式中，所述凝集素
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磁性載體偶聯復合物中，每1ml磁性載體上偶聯有1
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20mg，優選為5
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15mg，進一步優選為10
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15mg凝集素。上述磁性載體與凝集素偶聯后，使用不含外泌體的牛血清白蛋白緩沖液反應處理，得到最終的凝集素
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磁性載體偶聯復合物。
[0013]上述凝集素
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磁性載體偶聯復合物在某些實施方式中，所述臨床樣本包括：血清、血漿、唾液、組織或細胞培養上清液、尿液、腦脊液、淋巴液中的任意一種。
[0014]上述凝集素
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磁性載體偶聯復合物在某些實施方式中，所述凝集素包括：木菠蘿凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麥胚素、大豆凝集素、蕓豆凝集素中的任意一種或者兩種及以上。
[0015]上述凝集素
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磁性載體偶聯復合物在某些實施方式中，所述糖基化外泌體包括：N
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糖基化外泌體、O
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糖基化外泌體、巖藻糖基化外泌體中的任意一種或兩種及以上。
[0016]上述凝集素
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磁性載體偶聯復合物在某些實施方式中，所述凝集素
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磁性載體偶聯復合物保存在保存液中，所獲得的凝集素
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磁性載體偶聯復合物保存液中的凝集素
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磁性載體偶聯復合物的保存濃度(體積比)為10％
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60％，優選比例為30％
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50％，進一步優選為40％
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50％；凝集素
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磁性載體偶聯復合物保存液的體積是指凝集素
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磁性偶聯復合物分散在保存液中后，其與保存液的總體積。
[0017]本專利技術另一方面還提供了一種糖基化外泌體分離組合物，所述糖基化外泌體分離組合物包括：上述凝集素
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磁性載體偶聯復合物，還包括用于清洗去除分離過程中非特異性結合的、未發生糖基化的外泌體及其他雜質的清洗液，和/或用于洗脫特異性結合在凝集素
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磁性載體偶聯復合物上的糖基化外泌體的洗脫液。這里的組合物并非是指其混合為一體，而是指其獨立包裝并同時存在于一個套裝中。
[0018]上述糖基化外泌體分離組合物在某些實施方式中，所述清洗液為無金屬鹽離子的
清洗緩沖液或純化水，可選為本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種凝集素
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磁性載體偶聯復合物在分離臨床樣本中的糖基化外泌體中的應用，其特征在于：包括：磁性載體；和偶聯在磁性載體外側的凝集素；其中：所述凝集素包括：木菠蘿凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麥胚素、大豆凝集素、蕓豆凝集素、蝸牛凝集素(HAA和/或HPA)中的任意一種或者兩種及以上；所述磁性載體包括：葡聚糖磁珠、瓊脂糖磁珠、樹脂或環氧樹脂磁珠、聚苯乙烯磁珠中的任意一種或者兩種及以上。2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述磁性載體粒徑分布范圍為1μm
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200μm，優選為10μm
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200μm，更進一步優選為30μm
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150μm。3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述凝集素
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磁性載體偶聯復合物中，每1ml磁性載體上偶聯有1
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20mg，優選為5
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15mg，進一步優選為10
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15mg凝集素。4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述臨床樣本包括：血清、血漿、唾液、組織或細胞培養上清液、尿液、腦脊液、淋巴液中的任意一種。5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述凝集素包括：木菠蘿凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麥胚素、大豆凝集素、蕓豆凝集素中的任意一種或者兩種及以上。6.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述糖基化外泌體包括：N
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糖基化外泌體、O
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糖基化外泌體、巖藻糖基化外泌體中的任意一種或兩種及以上。7.一種糖基化外泌體分離組合物在分離臨床樣本中的糖基化外泌體中的應用，其特征在于，所述糖基化外泌體分離組合物包括：權利要求1
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6之一所述的應用中的凝集素
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磁性載體偶聯復合物，還包括：用于清洗去除分離過程中非特異性結合的、未發生糖基化的外泌體及其他雜質的清洗液，和用于洗脫特異性結合在凝集素
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磁性載體偶聯復合物上的糖基化外泌體的洗脫液，所述洗脫液使洗脫后的外泌體外觀形態完整，無破損或裂解。8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述清洗液為無金屬鹽離子的清洗緩沖液或純化水，可選地為無金屬鹽離子的清洗緩沖液；和/或，所述洗脫液為溶有...

【專利技術屬性】
技術研發人員：林長青，陳天圣，郝昆，黃鶴，高琦，李艷召，許智慧，郄霜，趙廣珍，
申請(專利權)人：北京堯景基因技術有限公司，
類型：發明
國別省市：