一種與綿羊肉質嫩度相關的基因多態位點的檢測方法及應用技術

本發明專利技術公開了一種與綿羊肉質嫩度相關的基因多態位點的檢測方法及應用。通過測序技術分析綿羊CCN5基因在群體中的遺傳多態性，并通過與個體肉質性狀數據相結合進行相關分析，發現可以依據CCN5基因第5外顯子上的多態位點對肉質嫩度優勢綿羊群體進行早期選擇。肉質嫩度優勢綿羊群體進行早期選擇。

【技術實現步驟摘要】
一種與綿羊肉質嫩度相關的基因多態位點的檢測方法及應用


[0001]本專利技術屬于基因檢測及畜禽品種改良與育種領域，具體涉及一種綿羊肉質嫩度相關單核苷酸多態性(SNP)標記的鑒定。

技術介紹

[0002]隨著經濟進步，居民生活水平不斷提高，餐飲業的蓬勃發展，羊肉越來越受大眾的歡迎。羊肉需求量增加的同時，人們對其肉質的要求也隨之升高。近年來，育種工作者們逐漸將研究方向轉移至綿羊肉質方面性狀的改善。羊肉整體品質由多種因素綜合影響，如肌內脂肪含量能夠顯著影響肉質的嫩度；羊肉中不飽和脂肪酸不僅會影響羊肉的風味而且還是人體所必需的營養物質。通過探知影響綿羊肉質性狀的候選基因及其上發生突變的位點與綿羊群體肉質性狀差異的關聯性，為綿羊提高肉質質量的分子育種工作提供了重要依據。早期研究揭示了與小尾寒羊前體脂肪細胞分化過程相關基因表達規律(DOI:10.16431/j.cnki.1671
?
7236.2019.07.018.)，但尚未確定影響肉質性狀的主要基因。
[0003]細胞間網絡通信因子5(cellular communication network factor 5,CCN5)參與機體多項生理過程，如細胞粘附、增殖、分化、遷移、成熟等。有研究表明，CCN5基因能夠影響間充質干細胞(MSCs)增殖和分化，并參與機體的脂肪代謝。但關于CCN5基因在家畜肉質方面的研究較少，影響機體肉質性狀的調控作用仍不明確。目前，對于CCN5基因SNP標記的探索處于停滯狀態。

技術實現思路

[0004]本專利技術的目的在于提供一種與綿羊肉質嫩度相關的基因多態位點的檢測方法及應用，為在固定群體里選擇肌內脂肪含量相對較高的綿羊個體提供一種快速有效的方法，為提高綿羊肉質品質的育種提供依據。
[0005]為達到上述目的，本專利技術采用了以下技術方案：
[0006]一種綿羊CCN5基因單核苷酸多態性的檢測方法，包括以下步驟：
[0007]以綿羊基因組DNA或綿羊離體生物材料所含DNA為模板，通過PCR擴增CCN5基因部分片段，利用該片段鑒定CCN5基因第5外顯子單核苷酸多態性位點的基因型。
[0008]優選的，所述單核苷酸多態性位點位于chr.13:7625253，該位點在綿羊(例如小尾寒羊)群體中存在C
?
G突變。
[0009]優選的，所述PCR的引物為：
[0010]上游引物：5
’?
AACGGAGGGAAGGACATCAAAT
?3’
(即SEQ.ID.NO.1)
[0011]下游引物：5
’?
AGCGGCTGACATAGAGTTTCCA
?3’
(即SEQ.ID.NO.2)。
[0012]優選的，所述綿羊離體生物材料為采集自綿羊個體的血液。
[0013]優選的，所述PCR的反應體系包括：50～150ng/μL綿羊基因組DNA 1～2μL或綿羊血樣1～2μL，以及10～20μmol/L上、下游引物各0.4～0.5μL。
[0014]優選的，所述PCR的反應條件包括：94℃5min；94～95℃30s，55～65℃30s，72℃
16s，共35個循環；72℃8min。
[0015]優選的，所述基因型的鑒定具體包括以下步驟：對所述片段進行測序，然后將測序結果與參考序列比對。
[0016]一種綿羊CCN5基因單核苷酸多態性的檢測試劑盒，該試劑盒包括用于通過PCR
?
測序法鑒定CCN5基因第5外顯子單核苷酸多態性位點的基因型的位點擴增引物(例如，上述上游引物和下游引物)。
[0017]上述綿羊CCN5基因單核苷酸多態性的檢測方法在綿羊分子標記輔助選擇育種中的應用。
[0018]優選的，所述單核苷酸多態性位點(具體為chr.13:7625253)的基因型為CG或CC的個體在肉質性狀上較優。
[0019]優選的，所述肉質性狀選自肌內脂肪含量。
[0020]優選的，所述綿羊選自小尾寒羊。
[0021]本專利技術的有益效果體現在：
[0022]本專利技術根據所發現的位于CCN5基因第5外顯子內的SNP位點，不僅可以實現對綿羊(例如小尾寒羊)群體CCN5基因進行快速、準確分型。而且基于該位點與個體肉質性狀的顯著相關性，可以運用分子標記(即SNP標記)在早期篩選肉品質(例如嫩度)好的綿羊個體，從而提高優勢肉羊(例如小尾寒羊)選育速度。
[0023]進一步的，與傳統的分型方法相比，本專利技術通過測序鑒定基因型，具有耗時短、成功率高，結果更直觀，以及可以大批量進行鑒定、選擇的優勢。
附圖說明
[0024]圖1為小尾寒羊CCN5基因第5外顯子部分區域擴增產物電泳圖；圖中Marker右側的5個泳道為不同個體樣本。
[0025]圖2為小尾寒羊CCN5基因第5外顯子部分區域測序圖；圖中WE5
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25
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W5R_E02/F02/G02/H02/A03/B03/C03.ab1RC代表不同個體樣本。
[0026]圖3為小尾寒羊CCN5基因(第5外顯子)不同基因型的測序峰圖；其中：A為CC基因型，B為GG基因型，C為CG基因型。
具體實施方式
[0027]下面結合附圖和實施例對本專利技術作進一步詳細說明。所述實施例僅用于解釋本專利技術，而非對本專利技術保護范圍的限制。
[0028](一)綿羊基因組候選區域篩選
[0029]本專利技術中選用具有代表性的肉羊品種小尾寒羊為實驗對象。實驗室前期通過轉錄組測序技術檢測實驗羊脂肪細胞分化過程中的差異表達基因。結果發現CCN5基因與實驗羊脂肪代謝相關，能夠影響實驗羊肉質性狀，而后一發現在此前沒有相關報道。隨后的實驗檢測發現，CCN5基因只有第5外顯子存在一個潛在的SNP位點。因此，將該位點與實驗羊肉質數據關聯分析，試圖證明CCN5基因存在與綿羊肉質性狀相關的SNP標記(具體參見以下實驗內容)。
[0030](二)綿羊樣本采集以及CCN5基因第5外顯子突變檢測
[0031]1.樣本采集
[0032]2021年10月對吉林省長春市吉林省農業科學院飼養的小尾寒羊進行血樣采集。血樣通過頸靜脈采血獲得，采集的血液存放在抗凝管中，置于4℃冰箱保存；共采集96只6月齡小尾寒羊。
[0033]2.突變檢測策略
[0034]根據綿羊CCN5基因序列，設計特異性引物，然后通過PCR克隆CCN5基因第5外顯子部分區域的DNA片段，對該DNA片段利用直接測序技術進行檢測，得到序列信息，然后根據綿羊基因組參考序列判定樣本的CCN5基因第5外顯子發生突變的情況。
[0035]3.引物設計
[0036]以綿羊CCN5基因DNA序列為參照(基因ID號：XM_027977228.2)設計1對引物，引物序列如下，目的片段長度為745bp：
[0037]CCN5基因exon5上游引物：5
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【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種綿羊CCN5基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：以綿羊基因組DNA或綿羊離體生物材料所含DNA為模板，通過PCR擴增CCN5基因部分片段，利用該片段鑒定CCN5基因第5外顯子單核苷酸多態性位點的基因型。2.根據權利要求1所述一種綿羊CCN5基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于：所述單核苷酸多態性位點位于chr.13:7625253，該位點在綿羊群體中存在C
?
G突變。3.根據權利要求1所述一種綿羊CCN5基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于：所述PCR的引物為：上游引物：5
’?
AACGGAGGGAAGGACATCAAAT
?3’
下游引物：5
’?
AGCGGCTGACATAGAGTTTCCA
?3’
。4.根據權利要求1所述一種綿羊CCN5基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于：所述綿羊離體生物材料為采集自綿羊個體的血液。5.根據權利要求1所述一種綿羊CCN5基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于...

【專利技術屬性】
技術研發人員：肖成，劉宇，曹陽，柳儉強，苑志宇，張立春，馬惠海，
申請(專利權)人：吉林省農業科學院，
類型：發明
國別省市：