一種特異性鑒定嘉興槜李種質(zhì)的ISSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種特異性鑒定嘉興槜李種質(zhì)的ISSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種ISSR分子標(biāo)記引物，使用該引物可以簡(jiǎn)單方便地通過(guò)PCR方法來(lái)鑒別嘉興槜李種質(zhì)。所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述ISSR分子標(biāo)記引物特征在于，序列為：5

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種特異性鑒定嘉興槜李種質(zhì)的ISSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)涉及一種特異性鑒定嘉興槜李種質(zhì)的ISSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用，屬于生物


技術(shù)介紹

[0002]槜李(Prunus salicina Lindl.)是薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus L.)植物，原產(chǎn)于浙江省嘉興市，桐鄉(xiāng)槜李于2011年獲農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志保護(hù)登記。槜李果實(shí)熟透后果肉化成漿液，有酒香味，品質(zhì)上乘，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。目前除浙江嘉興的桐鄉(xiāng)、海寧、海鹽、湖州等地有槜李栽培外，在江蘇、安徽等省也有少量引種。
[0003]槜李多采用嫁接繁殖，在不同栽培區(qū)域進(jìn)行引種嫁接，極易造成同名異物及同物異名的現(xiàn)象。另外槜李受不同栽培管理方法、土壤及氣候條件的影響，果實(shí)在成熟期的生物學(xué)特性及品質(zhì)外觀方面呈現(xiàn)一定的差異，市場(chǎng)上魚目混珠給消費(fèi)者帶來(lái)極大困惑。
[0004]傳統(tǒng)的植物分類方法是借助于對(duì)植物形態(tài)構(gòu)造、生活習(xí)性等進(jìn)行比較研究，隨著科技的不斷進(jìn)步，植物分類方法逐步發(fā)展到分子生物學(xué)方法。由于槜李的果實(shí)外觀受不同栽培管理方法、土壤及氣候條件的影響，果實(shí)色澤往往不同，僅僅依靠果實(shí)形態(tài)來(lái)區(qū)分槜李與其他品種李難度較大，依靠傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)方法在嘉興槜李的鑒別上存在局限性。鑒于嘉興槜李在地方特產(chǎn)及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重要地位，針對(duì)嘉興槜李建立一套可靠的分子鑒定方法勢(shì)在必行，對(duì)于嘉興槜李的種質(zhì)資源保護(hù)具有重要意義。
[0005]由于植物性狀通常受環(huán)境因素和遺傳基因的影響導(dǎo)致品種特性發(fā)生改變，僅靠形態(tài)特征較難區(qū)分開來(lái)，不利于種質(zhì)資源保護(hù)及開發(fā)利用。分子標(biāo)記技術(shù)不受環(huán)境條件和植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，已被廣泛用于植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，為分子輔助育種提供技術(shù)支持。ISSR是由Zietkiewicz等人于1994年創(chuàng)建的一種簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，具有實(shí)驗(yàn)操作快速簡(jiǎn)單高效、遺傳重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，二十余年來(lái)已廣泛地應(yīng)用于品種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、分子標(biāo)記育種等方面。喬玉山及等人用ISSR分子標(biāo)記對(duì)不同李品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，指出ISSR標(biāo)記是進(jìn)行李種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性研究的有力工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0006]本專利技術(shù)提供了一種ISSR分子標(biāo)記引物，使用該引物可以簡(jiǎn)單方便地通過(guò)PCR方法來(lái)鑒別嘉興槜李種質(zhì)。所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述ISSR分子標(biāo)記引物特征在于，序列為：5
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，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。
[0007]本專利技術(shù)通過(guò)設(shè)計(jì)和篩選獲得一個(gè)可以特異性鑒定嘉興槜李種質(zhì)的ISSR分子標(biāo)記，該標(biāo)記包含一條引物，利用該引物對(duì)李品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物大小的多態(tài)性即可鑒定嘉興槜李種質(zhì)。
[0008]本專利技術(shù)提供了一種ISSR分子標(biāo)記引物在鑒定嘉興槜李或在制備鑒定嘉興槜李的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述引物序列為：5
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，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,
T)。
[0009]本專利技術(shù)還提供了一種用于嘉興槜李的分子鑒定試劑盒，所述試劑盒含有上述ISSR分子標(biāo)記引物，所述引物序列為：5
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，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。
[0010]在本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式中，所述試劑盒中還含有PCR擴(kuò)增所需試劑。
[0011]在本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增的體系為：2.0μL 10
×
PCR緩沖液，0.5μLdNTP混合液，2.0μL ISSR分子標(biāo)記引物，1.0μL樣品DNA模板，0.2μL Taq DNA聚合酶，補(bǔ)dd H2O至20μL。
[0012]本專利技術(shù)還提供了一種鑒別嘉興槜李種質(zhì)的方法，所述方法為，提取待測(cè)樣本的基因組DNA作為模板，用ISSR分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并檢測(cè)，若出現(xiàn)一條大小為400bp的特異性條帶，則待檢測(cè)李樣品為嘉興槜李，所述引物序列為：5
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，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。
[0013]在本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增的體系為：2.0μL 10
×
PCR緩沖液，0.5μLdNTP混合液，2.0μL ISSR分子標(biāo)記引物，1.0μL樣品DNA模板，0.2μL Taq DNA聚合酶，補(bǔ)dd H2O至20μL。
[0014]在本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增條件為：
[0015]94℃預(yù)變性90s；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。
[0016]在本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式中，所述樣品DNA模板的濃度為20ng/μL。
[0017]在本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式中，所述ISSR分子標(biāo)記引物的濃度為2.5μM。
[0018]在本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式中，提取DNA時(shí)，可以采用李的葉片、莖、花等組織。對(duì)李DNA的提取方法也沒有特殊要求，可以為CTAB法、SDS提取法、ROSE一管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用試劑盒進(jìn)行DNA的提取。
[0019]在本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增的體系和條件影響鑒別的準(zhǔn)確性。
[0020]在本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式中，由于本專利技術(shù)在設(shè)計(jì)時(shí)，產(chǎn)生的特異性片段的大小為400bp左右，因此，可采用一般的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析即可，瓊脂糖的濃度可以為1.5％。
[0021]本專利技術(shù)還提供了上述試劑盒或上述方法在鑒定嘉興槜李種質(zhì)中的應(yīng)用。
[0022]有益效果
[0023](1)本專利技術(shù)ISSR標(biāo)記引物能夠有效鑒別嘉興槜李種質(zhì)，且使用PCR的方法與傳統(tǒng)的測(cè)序等方法相比，檢測(cè)速度快、成本低、操作簡(jiǎn)單。
[0024](2)本專利技術(shù)的ISSR標(biāo)記引物具有特異性好、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，使用所述分子鑒定試劑盒和方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)嘉興槜李的快速鑒定，避免因居群間的多樣性而導(dǎo)致假陽(yáng)性的發(fā)生，適用于市場(chǎng)上及生產(chǎn)中對(duì)嘉興槜李種質(zhì)的快速鑒定。
附圖說(shuō)明
[0025]圖1：嘉興槜李果實(shí)照片。
[0026]圖2：本專利技術(shù)的ISSR標(biāo)記對(duì)嘉興槜李及其他品種李的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖，其中，泳道2～26分別為：浙江嘉興槜李(早熟)(P1)、浙江嘉興槜李(中熟)(P2)、浙江嘉興槜李(晚
熟)(P3)、浙江寧波茄皮李(P4)、浙江舟山金塘李(P5)、福建芙蓉李(P6)、湖北玉皇李(P7)、貴州九阡李(P8)、浙江桐鄉(xiāng)黃姑李(P9)、安徽麥黃李(P10)、江西朱砂李(P11)、山東牛心李(P12)、黑龍江龍園秋李(P13)、日本大石早生(P14)、日本白李(P15)、日本秋姬(P16)、日本珍珠李(P17)、美國(guó)恐龍蛋(P18)、美國(guó)拉羅達(dá)(P19)、美國(guó)紅心(P20)、本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于鑒定嘉興槜李的ISSR分子標(biāo)記引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。2.權(quán)利要求1所述的ISSR分子標(biāo)記引物在鑒定嘉興槜李或在制備鑒定嘉興槜李的產(chǎn)品中的應(yīng)用。3.一種用于嘉興槜李的分子鑒定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求1所述的ISSR分子標(biāo)記引物。4.如權(quán)利要求3所述的分子鑒定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還含有PCR擴(kuò)增所需試劑。5.一種鑒別嘉興槜李種質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法為，提取待測(cè)樣本的基因組DNA作為模板，用權(quán)利要求1所述ISSR分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并檢測(cè)，若出現(xiàn)一條大小為400bp的特異性條帶，則待檢測(cè)李樣品為嘉興槜李。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李軍，高廣春，李白，劉洋，汪霞，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：