一種酶抑制型金納米比色傳感器定量檢測黃曲霉素的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種酶抑制型金納米比色傳感器定量檢測黃曲霉素的方法，屬于黃曲霉素檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)以金納米粒子作為探針，基于該材料構(gòu)建了一種簡單、靈敏的比色傳感器用于檢測黃曲霉素。通過表征和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明構(gòu)建的該傳感器具有良好的選擇性和功能性，可以成功地用于黃曲霉素的定量檢測。該黃曲霉素的檢測方法的線性范圍是0.05～10μg/mL，檢測限為0.03μg/mL。與傳統(tǒng)的方法相比，本實(shí)驗(yàn)不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，研究方法快速便捷、易于操作和觀察，得到了比較好的結(jié)果反饋。得到了比較好的結(jié)果反饋。得到了比較好的結(jié)果反饋。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種酶抑制型金納米比色傳感器定量檢測黃曲霉素的方法


[0001]本專利技術(shù)屬于黃曲霉素檢測
，具體涉及一種酶抑制型金納米比色傳感器定量檢測黃曲霉素的方法。

技術(shù)介紹

[0002]黃曲霉素(Aflatoxins，AFs)的主要類型有B1、G1、B2和G2。由霉菌自然產(chǎn)生的大概有13種，另外是從動物、微生物和人類產(chǎn)生的有毒代謝衍生物中產(chǎn)生的。在這些化合物中AFM1非常重要，需要大力關(guān)注，以遏制其在乳制品中的流行。同時(shí)，其他衍生物也很普遍，因?yàn)樗鼈兛梢匝杆俎D(zhuǎn)化為有效的AFB1，并可以成為合成其他有效真菌毒素的中間體。每年，世界上相當(dāng)一部分農(nóng)作物(特別是玉米)和油籽供應(yīng)將受到AFs污染。它不僅對經(jīng)濟(jì)而且對人類健康造成很大的負(fù)面影響。在這些類型中，AFB1主要存在于食物樣本中，研究發(fā)現(xiàn)它是最有效的天然致癌物質(zhì)。黃曲霉素B1(AFB1)是這些化合物中最有效的，已經(jīng)被很好地描述為是導(dǎo)致人和動物肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生因素之一。
[0003]黃曲霉素廣泛存在于土壤中，而癌癥患病率不斷上升的重要因素之一也是因?yàn)槭称分悬S曲霉素含量超標(biāo)。黃曲霉素含量太高的食品會被完全丟棄，這導(dǎo)致了農(nóng)業(yè)行業(yè)的巨額年度虧損。而其對人們生活健康帶來的危害也已經(jīng)引起了社會的廣泛關(guān)注。黃曲霉素的一個(gè)很大的副作用是對人類免疫系統(tǒng)的影響。黃曲霉素AFB1會影響人類的器官和某些系統(tǒng)，例如肺部免疫系統(tǒng)，這些都會導(dǎo)致人類存在不同的健康問題。有多項(xiàng)研究都證明了黃曲霉素對免疫系統(tǒng)具有負(fù)面影響。黃曲霉素污染事件層出不窮。食品安全與人體健康越來越受到各類相關(guān)部門的重視，其作為一種重要的真菌毒素，是世界范圍內(nèi)各種食品的天然污染物。
[0004]目前，在儀器分析技術(shù)中，檢測AFB1常用的方法是儀器分析方法，其中常規(guī)分析方法有以下幾種：
[0005]薄層分析法，是一種快速、實(shí)用的定量和半定量測定各種底物中黃曲霉素的方法，該方法是黃曲霉素最經(jīng)典的測定方法，在早期檢測中最常見，是國家標(biāo)準(zhǔn)方法之一。對于黃曲霉素有很多的檢測方法，中外檢測機(jī)構(gòu)仍采用該方法進(jìn)行檢測。TLC方法的主要優(yōu)點(diǎn)是可以微量、快速、簡單的分析樣品。這種方法的可靠性在很大程度上取決于操作員的經(jīng)驗(yàn)。
[0006]高效液相色譜具有高分離能力、非常靈敏、使用方便、易于自動化、重現(xiàn)性良好，可與不同檢測器聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)。
[0007]酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)層析方法需要昂貴的儀器和在層析領(lǐng)域的專業(yè)知識。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)作為檢測黃曲霉素的傳感器是另一種實(shí)用的黃曲霉素檢驗(yàn)方式。該試驗(yàn)是一種快速而靈敏的食品常規(guī)分析技術(shù)，只需極少的樣品清理。該方法適用于快速、靈敏、樣品吞吐量高、進(jìn)樣量要求低的分析。雖然ELISA法的檢測限低于用于黃曲霉素檢測的儀器技術(shù)，但會影響結(jié)果。因此，如果樣品中含有復(fù)雜的基質(zhì)，那么與TLC和HPLC法相比，ELISA法就不那么可靠了。
[0008]但這些方法有的高靈敏度，但儀器貴；有的具有良好重現(xiàn)性，但樣品處理繁瑣，極
大地限制了AFB1的快速檢測和現(xiàn)場篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0009]本專利技術(shù)針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本專利技術(shù)以金納米粒子作為探針，基于該材料構(gòu)建了一種簡單、靈敏的比色傳感器用于檢測黃曲霉素。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案為：
[0011]一種酶抑制型金納米比色傳感器定量檢測黃曲霉素的方法，包括以下步驟：
[0012](1)金納米溶液AuNPs的制備：配置150mL 1mmol/L的HAuCl4溶液，置于容器中，加熱，并持續(xù)攪拌，在溶液即將到達(dá)沸點(diǎn)時(shí)，加入15mL 10mg/mL的檸檬酸鈉溶液，目的是消除AuNPs之間的靜電作用，使得AuNPs分散良好；持續(xù)攪拌加熱，使得混合液處于沸騰狀態(tài)，直至溶液由淡黃色變?yōu)樯罹萍t色停止加熱，持續(xù)攪拌降至室溫，抽濾，得到金納米溶液AuNPs；
[0013](2)純化碘化硫代乙酰膽堿：稱取0.5mmol碘化硫代乙酰膽堿ATI溶解于5mL純凈的蒸餾水中，加入0.6mM AgNO3，溶液會立即產(chǎn)生大量的AgI沉淀，再加入1.0mL
[0014]0.2mol
·
L
?1的NaCl，然后通過高速離心除去沉淀，得到硫代乙酰膽堿ATCh，并將硫代乙酰膽堿ATCh配置為5μmol/L、pH為7.0的PBS緩沖溶液后使用；
[0015](3)檢測樣品中黃曲霉素含量：先將步驟(1)制備好的金納米溶液AuNPs稀釋5倍得到稀釋液；取3.6mL稀釋液，加入40μL乙酰膽堿酯酶，再依次加入0.4mL待測樣品溶液，最后加入0.1mL步驟(2)所得硫代乙酰膽堿緩沖溶液，將混合后的溶液放在室溫下進(jìn)行反應(yīng)；最后在分光光度計(jì)上測量522nm處的吸收光譜并記錄數(shù)據(jù)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃曲霉素的含量。
[0016]進(jìn)一步的，步驟(1)在使用各類器皿前，首先要沖洗干凈所需儀器。清洗前，先用王水浸泡一段時(shí)間，在流動的水流中沖洗干凈，然后使用數(shù)控超聲波清洗器將其洗凈，最后用蒸餾水進(jìn)行多次沖洗直至不會聚成水滴后，放入烘箱中待用。
[0017]進(jìn)一步的，步驟(1)過濾時(shí)使用一次性針管進(jìn)行抽濾，所使用的過濾膜為孔徑為0.45μm的水性膜。
[0018]進(jìn)一步的，步驟(2)離心轉(zhuǎn)速為13000rpm。
[0019]進(jìn)一步的，步驟(3)乙酰膽堿酯酶的酶濃度為2500mU/mL
[0020]進(jìn)一步的，步驟(3)進(jìn)行實(shí)際檢測時(shí)，試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)三次，取平均值，以提升檢測準(zhǔn)確度。
[0021]納米材料由以納米為單位的顆粒組成，其直徑在1
?
100nm之間。其具有較為優(yōu)良的性能，在生物醫(yī)藥、生物工程等研究領(lǐng)域都扮演了重要的角色。
[0022]金納米材料具有以下幾處優(yōu)點(diǎn)，例如尺寸與光學(xué)性質(zhì)有關(guān)、易于制備和偶聯(lián)、比表面積大、穩(wěn)定性和生物兼容性等，已成為最受歡迎的光學(xué)傳感NMS。金納米粒子在可見光區(qū)具有很強(qiáng)的SPR吸收，這在很大程度上是由于其表面電子與入射電磁輻射共振的集體振蕩。
[0023]AuNPs可以很容易地被識別元件修飾，包括烷基硫化物、谷胱甘肽、硫代化DNA/RNA以及硫代化肽和蛋白質(zhì)。其中特別的基于DNA/RNA的識別元件用于功能化Au NMS是適配子，主要是因?yàn)樗鼈儗Ψ治鑫锞哂刑禺愋院头€(wěn)定性。
[0024]本專利技術(shù)檢測方法的檢測原理為：
[0025]黃曲霉素AFs對乙酰膽堿酯酶AChE存在一定的抑制和阻礙作用。
[0026]原理為：由于硫代乙酰膽堿ATCh帶正電荷，將其作為乙酰膽堿酯酶AChE的基底物質(zhì)，金納米材料作為探針，由于靜電引力的作用，ATCh會吸附在帶負(fù)電的金納米材料表面。ATCh被乙酰膽堿酯酶催化水解成為硫代膽堿，硫代膽堿表面有正電荷，且有一個(gè)巰基(
?
SH)在硫代膽堿表面。Au
?
SH鍵是起決定作用的，它在金納米粒子和巰基之間形成，因此，AuNPs的表面會使得硫代膽堿結(jié)合上去，這樣由于靜電引力作用和AuNPs和
?
...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種酶抑制型金納米比色傳感器定量檢測黃曲霉素的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)金納米溶液AuNPs的制備：配置150mL 1mmol/L的HAuCl4溶液，置于容器中，加熱，并持續(xù)攪拌，在溶液即將到達(dá)沸點(diǎn)時(shí)，加入15ml 10mg/mL的檸檬酸鈉溶液，持續(xù)攪拌加熱，使得混合液處于沸騰狀態(tài)，直至溶液由淡黃色變?yōu)樯罹萍t色停止加熱，持續(xù)攪拌降至室溫，過0.45μm的濾膜，得到金納米溶液AuNPs；(2)純化碘化硫代乙酰膽堿：稱取0.5mmol碘化硫代乙酰膽堿ATI溶解于5mL純凈的蒸餾水中，加入0.6mM AgNO3，溶液會立即產(chǎn)生大量的AgI沉淀，再加入1.0mL 0.2mol.L
?1的NaCl，然后通過高速離心除去沉淀，得到硫代乙酰膽堿ATCh，并將硫代乙酰膽堿ATCh配置為5μmol/L、pH為7.0的PBS緩沖溶液后使用；(3)檢測樣品中...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：宋興良，陳配財(cái)，胡雪萍，徐源霞，曹晉瑜，
申請(專利權(quán))人：臨沂大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：