一種轉(zhuǎn)基因智能不育系材料及其后代中內(nèi)、外源基因的檢測引物和鑒定方法技術

本發(fā)明專利技術提供了一種轉(zhuǎn)基因智能不育系材料及其后代中內(nèi)、外源基因的檢測引物和鑒定方法，屬于植物生物技術領域。本發(fā)明專利技術的檢測引物包含一條正向引物SEQ ID NO.1和兩條反向引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。利用本發(fā)明專利技術的引物，只需通過常規(guī)的PCR和PAGE膠電泳即可區(qū)分轉(zhuǎn)基因材料及其自交、雜交、回交后代中的內(nèi)、外源基因，以及各種內(nèi)、外源基因組成的基因型，從而在轉(zhuǎn)基因材料當代和后代的繁殖及轉(zhuǎn)育過程中，提高對目標基因型的選擇效率。本發(fā)明專利技術提供的方法操作簡便、分型快速、結果直觀準確，在植物育種技術領域中應用前景廣闊。技術領域中應用前景廣闊。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種轉(zhuǎn)基因智能不育系材料及其后代中內(nèi)、外源基因的檢測引物和鑒定方法


[0001]本專利技術涉及植物分子遺傳育種
，具體地涉及一種鑒別轉(zhuǎn)基因智能不育系水稻及其自交、雜交、回交后代中內(nèi)、外源GMS2基因型的分子標記及其應用。

技術介紹

[0002]水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是我國的主要糧食作物。雄性不育是指雄性生殖器官無法產(chǎn)生正?；ǚ?，而雌性生殖器官發(fā)育正常，能接受正?；ǚ鄱芫Y實的現(xiàn)象。水稻是自花授粉作物，利用雄性不育迫使水稻接受外來花粉，既可以利用雜種優(yōu)勢提高水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性，又可以實現(xiàn)大規(guī)模雜交種制備，在雜交水稻產(chǎn)業(yè)中具有十分重要的意義。海南波蓮水稻基因科技有限公司于2013年用鈷60對秈稻材料9311進行輻射，篩選獲得一份隱性核雄性不育材料，命名為gms2。該突變性狀由GMS2基因在基因編碼區(qū)第118位～126位的AACAGCTAC堿基發(fā)生缺失，導致LOC_Os04g48490基因編碼蛋白的第40、41和42位的天冬酰胺、絲氨酸和酪氨酸缺失。
[0003]GAT(Genetic Automation Technology，GAT)技術是一種新型的雜交種子育制種技術，該技術可成功利用隱性核雄性不育系，其核心思路是利用現(xiàn)代生物技術，將農(nóng)作物花粉育性恢復基因、花粉敗育基因、除草劑敏感基因、篩選標記基因等按特定順序和方向緊密連鎖地構建在GAT載體上，通過高通量基因轉(zhuǎn)化技術導入到隱性核雄性不育系中，獲得大量轉(zhuǎn)化事件。由于多基因轉(zhuǎn)化過程中經(jīng)常出現(xiàn)部分基因轉(zhuǎn)入、各轉(zhuǎn)基因元件無法同時發(fā)揮功能及轉(zhuǎn)基因沉默等問題，故多基因轉(zhuǎn)化經(jīng)常出現(xiàn)無法篩選獲得均達目的性狀的轉(zhuǎn)化事件。經(jīng)過對各功能元件的篩選，獲得元件均發(fā)揮正常功能的初始保持系，創(chuàng)造隱性核雄性不育系的保持系，用于GAT不育系和雜交種的生產(chǎn)，從而成功實現(xiàn)隱性核雄性不育系的保持和繁殖，進而實現(xiàn)隱性核雄性不育系的商業(yè)化利用。在將上述gms2突變體及相應的GMS2突變基因用于GAT雜交水稻技術的研發(fā)過程中，如何有效區(qū)分轉(zhuǎn)基因植株及其自交、雜交、回交后代中外源GMS2轉(zhuǎn)基因(即育性恢復基因)、內(nèi)源野生型GMS2基因和內(nèi)源突變型GMS2基因成為一個需要克服的問題。
[0004]轉(zhuǎn)基因檢測大致分為基于轉(zhuǎn)基因植物的核酸水平檢測和蛋白水平檢測兩類(Querci M,Van den Bulcke M(2010)New approaches in GMO detection.Anal Bioanal Chem 396(6):1991
?
2002)。其中，基于核酸水平的檢測具有檢測方便、體系成熟、可檢測范圍廣及通量高等特點，因此使用較為廣泛(Elenis D,Kalogianni D(2008)Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms.Anal Bioanal Chem 392(3):347
?
54)?；诤怂崴降臋z測方法按具體應用又可以分為以下幾種：1、傳統(tǒng)定性PCR檢測技術；2、熒光定量PCR檢測技術；3、多重PCR檢測技術；4、核酸雜交檢測技術；5、基因芯片檢測技術等。
[0005]為了解決在轉(zhuǎn)基因植株及其自交、雜交、回交后代中有效區(qū)分外源GMS2轉(zhuǎn)基因、內(nèi)源野生型和突變型GMS2基因及其組合的問題，本專利技術通過在外源GMS2轉(zhuǎn)基因中引入SNP，并
結合gms2中GMS2基因的突變位點，設計引物，通過傳統(tǒng)PCR即實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)基因材料及其后代中內(nèi)、外源基因的基因定性分型。本鑒定方法操作簡便，成本低廉，通量可控，特別適合小、微企業(yè)的研究和生產(chǎn)需要。

技術實現(xiàn)思路

[0006]本專利技術的本專利技術的第一個目的在于克服現(xiàn)有技術存在的缺點與不足，提供一種鑒別轉(zhuǎn)基因水稻及其自交、雜交、回交后代中內(nèi)、外源GMS2基因的分子標記和引物組合。
[0007]本專利技術的第二個目的是提供利用上述標記和引物組合區(qū)分轉(zhuǎn)基因水稻及其自交、雜交、回交后代中內(nèi)、外源GMS2基因并鑒定植株基因型的方法及其應用。
[0008]本專利技術的第三個目的是提供利用上述分子標記預測轉(zhuǎn)基因水稻材料及其自交、雜交、回交后代的花粉育性。
[0009]本專利技術提供的一種鑒別轉(zhuǎn)基因水稻中內(nèi)、外源GMS2基因的分子標記，其通過核苷酸序列如SEQ ID NO.1
?
3所示的引物擴增得到。
[0010]本專利技術提供了上述分子標記在鑒定轉(zhuǎn)基因水稻中內(nèi)、外源GMS2基因型中的應用。
[0011]本專利技術提供了利用上述分子標記預測轉(zhuǎn)基因水稻材料及其自交、雜交、回交后代的花粉育性的應用。
[0012]本專利技術提供了前述分子標記、引物組合或試劑盒在作物育種或種質(zhì)資源改良中的應用。
[0013]所述的作物包括但不限于水稻、玉米、大豆、小麥、大麥、小米、高粱。
[0014]本專利技術提供的一種用于檢測轉(zhuǎn)基因水稻及其自交、雜交、回交后代中內(nèi)、外源GMS2基因型的引物組合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1
?
3所示的引物。
[0015]含有所述引物組合的試劑盒屬于本專利技術的保護范圍。
[0016]本專利技術的SEQ ID NO.1所示的正向引物F1：GAGCTCGGAGCCGTAGGA，SEQ ID NO.2所示的正向引物F2：GTGAGCACGAGGCAGGTG，和SEQ ID NO.3所示的反向引物R:CCGGAGTACTCGCTGTAC。
[0017]本專利技術上述引物組合是針對野生型GMS2基因(其序列信息記載于中國專利中，專利申請?zhí)枺?02010491115.0)的編碼區(qū)第118位～126位的AACAGCTAC堿基發(fā)生缺失，以及基因編碼區(qū)第174位與外源GMS2轉(zhuǎn)基因(即育性恢復基因)的SNP多態(tài)性(C/G)、第304及305位與外源基因的SNP多態(tài)性(AG/TC)設計、篩選后獲得。外源GMS2轉(zhuǎn)基因中的兩個SNP為人為引入，是同義突變。由于野生型品種中含有該轉(zhuǎn)基因?qū)膬?nèi)源基因，本申請在不改變所編碼的氨基酸序列的條件下，做這樣SNP的引入進行基因修飾，是為了區(qū)分植物基因組本身的內(nèi)源基因與導入的外源基因。本專利技術引入SNP的位置確保在引起功能變化的序列差異位點(即gms2突變位點)的300bp范圍內(nèi)，便于設計引物和控制PCR產(chǎn)物大小。
[0018]引物F1只能與修飾過密碼子的外源GMS2轉(zhuǎn)基因配對，引物F2只能與野生型GMS2基因配對，引物R可以與野生型和突變型內(nèi)源基因配對。此外，F(xiàn)1的3
’
端第四個堿基引入C
→
A的人為錯配突變，以便于提高F1和R對目標序列的相對識別能力。
[0019]進一步地，本專利技術提供了一種檢測轉(zhuǎn)基因材料及其自交、雜交、回交后代中內(nèi)、外源GMS2基因及基因型的方法，首先對待測樣本提取基因組DNA后，利用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的正向引物和SEQ 本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種鑒別轉(zhuǎn)基因智能不育系材料及其自交、雜交、回交后代中內(nèi)、外源GMS2基因的分子標記，其特征在于，通過核苷酸序列如SEQ ID NO.1
?
3所示的引物擴增得到。2.一種用于檢測轉(zhuǎn)基因智能不育系材料及其自交、雜交、回交后代中內(nèi)、外源GMS2基因的基因型的引物組合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1
?
3所示的引物。3.含有權利要求2所述引物組合的試劑盒。4.權利要求1所述的分子標記或權利要求2所述的引物組合或權利要求3所述的試劑盒在作物育種或種質(zhì)資源改良中的應用。5.權利要求1所述的分子標記或權利要求2所述的引物組合或權利要求3所述的試劑盒在鑒別轉(zhuǎn)基因智能不育系作物及其自交、雜交、回交后代中內(nèi)源基因GMS2和外源基因GMS2及內(nèi)、外源基因不同基因型組合中的應用。6.權利要求4或5所述的應用，其特征在于，所述的作物包括水稻、玉米、大豆、小麥、大麥、小米、高粱。7.檢測轉(zhuǎn)基因智能不育系材料GMS2基因型的方法，其特征在于，對待測樣本提取基因組DNA后，利用SEQ ID NO.1
?
3所示的引物組合進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳，根據(jù)電泳條帶確定轉(zhuǎn)基因材料的基因型。8.鑒別轉(zhuǎn)基因智能不育系材料中內(nèi)、外源GMS2基因的方法，其特征在于，對待測樣本提取基因組DNA后，利用SEQ ID NO.1
?
3所示的引物組合進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳，根據(jù)電泳條帶大小確定轉(zhuǎn)基因材料中的GMS2基因是內(nèi)源還是外源基因。9.如...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：唐杰，龍湍，吳春瑜，李佳林，劉昊，韓曉斌，李新鵬，曾翔，吳永忠，黃培勁，
申請(專利權)人：海南波蓮水稻基因科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：