使用熱穩定酶的受控且不依賴于模板的核酸合成制造技術

本發明專利技術涉及不依賴于模板的核酸合成方法，所述方法包括在存在古細菌DNA引物酶或其功能活性片段和/或變體的情況下，使包含具有游離3

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】使用熱穩定酶的受控且不依賴于模板的核酸合成


[0001]本專利技術涉及核酸合成或測序領域，更具體地涉及不依賴于模板的核酸合成的方法，所述方法包括在古細菌DNA引物酶或其功能活性片段和/或變體存在的情況下，使包含具有游離3
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羥基的3
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末端核苷酸的起始序列與至少一種核苷三磷酸或核苷三磷酸的組合反復接觸，從而使所述核苷三磷酸共價結合至所述3
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末端核苷酸的游離3
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羥基。
[0002]本專利技術還涉及古細菌DNA引物酶的分離的功能活性片段，這些片段能夠具有不依賴于模板的末端核苷酸轉移酶活性，但不具備從頭開始(ab
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initio)的單鏈核酸合成活性。
[0003]專利技術背景
[0004]不依賴于模板的序列受控的核酸合成是一個重大的行業挑戰。
[0005]許多生產者都能夠通過化學方法合成DNA或RNA鏈，然而他們很快就遭遇了這些生產方法的局限性。今天，核酸化學合成的黃金方法是亞磷酰胺法，它開發于20世紀80年代，后來通過固相支持和自動化得到加強((Beaucage&Caruthers，1981.Tetrahedron Lett.22(20)：1859
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62；McBride&Caruthers，1983.Tetrahedron Lett.24(3)：245
?
8；Beaucage&Iyer，1992.Tetrahedron.48(12)：2223
?
2311)。
[0006]然而，這種方法有很大的局限性：首先，只能合成不超過大約250個核苷酸的核酸。其次，亞磷酰胺法需要使用的有機溶劑可能是致癌物、生殖危害物和神經毒素；而合成的副產品可能還是有毒和污染性的。
[0007]為了克服這些問題，近來已經開發了一種新的，通過酶促方式進行的，不依賴于模板的，序列受控的核酸合成方法。它基于末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)的使用，這種酶能夠在沒有模板鏈的情況下合成單鏈DNA片段。因此，利用可逆的3
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受阻斷的核苷三磷酸，這種“不依賴于模板”的特性被用于核酸的序列受控的合成。
[0008]然而，TdT的使用也有其自身的局限性，特別是在長核酸或富含鳥嘌呤
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胞嘧啶的序列的合成過程中。事實上，在這兩種情況下，合成的DNA鏈傾向于自身折疊和形成二級結構，從而掩蓋了所述鏈的3
’
位置并最終導致最終合成產率急劇下降。
[0009]正在探索解決此問題的方法。特別是，新加坡的作者最近開發了一種鑒定熱穩定性TdT變體的方法(Chua et al.，2020.ACS Synth Biol.9(7)：1725
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1735)。簡而言之，他們使用一種容易出錯的聚合酶生成了一個TdT突變體庫，并篩選了這些TdT突變體中的大約10000個。他們最終確定了一種TdT變體，其熱穩定性比牛源野生型TdT(最佳溫度約為37℃，解鏈T
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約為40℃)高10℃，同時保留了其催化特性。與此同時，另一個研究小組報告了類似的結果，他們使用計算機驅動的方法鑒定了一種TdT變體，該變體的熱穩定性比小家鼠(Mus musculus)的野生型TdT高10℃(Barthel et al.，2020.Genes(Basel).11(1)：102)。
[0010]雖然很有前途，但這一發現尚未解決上述所有問題，他們仍然需要一種酶，其能夠在60℃至95℃之間的溫度下進行不依賴于模板的序列受控的合成，以避免形成任何二級結構并增加最終的核酸合成產量。
[0011]本專利技術提供了這樣的手段和方法。

技術實現思路

[0012]本專利技術涉及一種不依賴于模板的核酸合成方法，所述方法包括在存在屬于引物酶
?
聚合酶家族的古細菌DNA引物酶的引物酶結構域或其功能活性變體的情況下，使包含具有游離3
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羥基的3
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末端核苷酸的起始序列與至少一種核苷三磷酸或核苷三磷酸的組合反復接觸，從而使所述核苷三磷酸共價結合到所述3
’?
末端核苷酸的游離3
’?
羥基，其中所述功能活性變體能夠具有不依賴于模板的末端核苷酸轉移酶活性但不具備從頭開始的單鏈核酸合成活性。
[0013]在一個實施方案中，所述古細菌DNA引物酶或其功能活性變體來自火球菌屬(Pyrococcus)的古細菌。在一個實施方案中，所述古細菌DNA引物酶或其功能活性變體是火球菌屬種12
?
1DNA引物酶。在一個實施方案中，所述屬于引物酶
?
聚合酶家族的古細菌DNA引物酶或其功能活性變體是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的火球菌屬12
?
1DNA引物酶。
[0014]在一個實施方案中，所述屬于引物酶
?
聚合酶家族的古細菌DNA引物酶的引物酶結構域是火球菌屬12
?
1DNA引物酶的引物酶結構域，其具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或其功能活性片段和/或變體，所述功能活性片段和/或變體：
[0015]?
與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性；并且
[0016]?
能夠具有不依賴于模板的末端核苷酸轉移酶活性；并且
[0017]?
不具備從頭開始的單鏈核酸合成活性。
[0018]在一個實施方案中，所述屬于引物酶
?
聚合酶家族的古細菌DNA引物酶的引物酶結構域是火球菌屬12
?
1DNA引物酶的引物酶結構域，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或其功能活性片段和/或變體，所述功能活性片段和/或變體：
[0019]?
與SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性；并且
[0020]?
能夠具有不依賴于模板的末端核苷酸轉移酶活性；并且
[0021]?
不具備從頭開始的單鏈核酸合成活性。
[0022]在一個實施方案中，起始序列(initiator sequence)固定在支持物上。在一個實施方案中，起始序列是單鏈核酸引物。
[0023]在一個實施方案中，核酸的不依賴于模板的合成在約60℃至約95℃的溫度范圍內進行。
[0024]在一個實施方案中，所述方法用于不依賴于模板的具有隨機核苷酸序列的核酸的合成，并且所述至少一種核苷三磷酸或核苷三磷酸的組合不包括終止核苷三磷酸(terminating nucleoside triphosphate)。
[0025]在一個實施方案中，所述方法用于核酸的不依賴于模板的序列受控的合成，并且所述至少一種核苷三磷酸是包含可逆3
′?
阻斷基團(reversib本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.一種不依賴于模板的核酸合成方法，所述方法包括在存在屬于引物酶
?
聚合酶家族的古細菌DNA引物酶的引物酶結構域或其功能活性變體的情況下，使包含具有游離3
’?
羥基的3
’?
末端核苷酸的起始序列與至少一種核苷三磷酸或核苷三磷酸的組合反復接觸，從而使所述核苷三磷酸共價結合到所述3
’?
末端核苷酸的游離3
’?
羥基，其中所述功能活性變體能夠具有模板非依賴性末端核苷酸轉移酶活性但不具備從頭開始的單鏈核酸合成活性。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述古細菌DNA引物酶或其功能活性變體來自火球菌屬(Pyrococcus)的古細菌。3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述古細菌DNA引物酶或其功能活性變體是火球菌屬種(Pyrococcus sp.)12
?
1DNA引物酶。4.根據權利要求1
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3中任一項所述的方法，其中所述屬于引物酶
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聚合酶家族的古細菌DNA引物酶或其功能活性變體為具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的火球菌屬種12
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1DNA引物酶。5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中屬于引物酶
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聚合酶家族的古細菌DNA引物酶的所述引物酶結構域是具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的火球菌屬種12
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1DNA引物酶的引物酶結構域，或其功能活性片段和/或變體，所述功能活性片段和/或變體：
?
與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性；并且
?
能夠具有不依賴于模板的末端核苷酸轉移酶活性；并且
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不具備從頭開始的單鏈核酸合成活性。6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中屬于引物酶
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聚合酶家族的古細菌DNA引物酶的所述引物酶結構域是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的火球菌屬種12
?
1DNA引物酶的引物酶結構域，或其功能活性片段和/或變體，所述功能活性片段和/或變體：
?
與SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性；并且
?
能夠具有不依賴于模板的末端核苷酸轉移酶活性；并且
?
不具備從頭開始的單鏈核酸合成活性。7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述起始序列被固定在支持物上。8.如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述起始序列為單鏈核酸引物。9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述不依賴于模板的核酸合成在約60℃至約95℃的溫度范圍內進行。10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述方法用于不依賴于模板的具有隨機核苷酸序列的核酸的合成，并且所述至少一種核苷三磷酸或核苷三磷酸的組合不包括終止核苷三磷酸。11.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述方法用于不依賴于模板的序列受控的核酸合成，并且所述至少一種核苷三磷酸為包含可逆3
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阻斷基團的終止核苷三磷酸...

【專利技術屬性】
技術研發人員：I，
申請(專利權)人：辛希克斯，
類型：發明
國別省市：