一種牛源A型多殺性巴氏桿菌減毒株及其制備方法和應用技術

本發明專利技術提供了一種牛源A型多殺性巴氏桿菌減毒株及其制備方法和應用，屬于生物制品技術領域。本發明專利技術提供的牛源A型多殺性巴氏桿菌減毒株PmCQ2Δ889

【技術實現步驟摘要】
一種牛源A型多殺性巴氏桿菌減毒株及其制備方法和應用


[0001]本專利技術屬于生物制品
，具體涉及一種牛源A型多殺性巴氏桿菌減毒株及其制備方法和應用。

技術介紹

[0002]多殺性巴氏桿菌是一種重要的人畜共患致病菌，可導致多種家禽家畜，甚至人類患病，主要包括禽霍亂、豬的萎縮性鼻炎和肺疫、牛羊的出血性敗血病和肺炎等。這給養殖業帶來了巨大的經濟損失，同時也威脅著人類的生命安全。
[0003]根據莢膜血清型不同，多殺性巴氏桿菌可分為A、B、D、E和F型五種血清型，A型主要引起牛肺炎。該病的防控主要以抗生素和疫苗為主，但是抗生素濫用存在耐藥和環境污染等問題，疫苗防控是預防該病的主要措施。疫苗的制備一般采用減毒株制備得到。目前為止，國內尚無針對A型多殺性巴氏桿菌的有效疫苗，且不同血清型疫苗間交叉保護作用較差。

技術實現思路

[0004]有鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株，通過缺失野生型多殺性巴氏桿菌基因組中889，890，891，892，893和894這6個基因，降低了動物的致病力，同時對多種血清型多殺性巴氏桿菌具有一定的保護作用。
[0005]本專利技術提供了一種牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株，在牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2的基礎上，缺失基因組中889，890，891，892，893和894基因。
[0006]優選的，889基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0007]890基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0008]891基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0009]892基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0010]893基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0011]894基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0012]本專利技術提供了所述牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株的構建方法，包括以下步驟：
[0013]以牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2的基因組DNA為模板，分別以引物Pm889
?
894U
?
F/Pm889
?
894U
?
R擴增Pm889
?
894基因的上游同源臂，用引物Pm889
?
894D
?
F/Pm889
?
894D
?
R擴增Pm889
?
894基因的下游同源臂；
[0014]將所述Pm889
?
894基因的上游同源臂和擴增Pm889
?
894基因的下游同源臂克隆至pUC19oriKan
R
質粒中，得到缺失基因重組質粒pUC19oriKanRΔ889
?
894；
[0015]將所述缺失基因重組質粒pUC19oriKanRΔ889
?
894轉化入PmCQ2感受態細胞中，得到PmCQ2Δ889
?
894。
[0016]優選的，所述引物Pm889
?
894U
?
F/Pm889
?
894U
?
R的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和
SEQ ID NO:8所示。
[0017]優選的，所述引物Pm889
?
894D
?
F/Pm889
?
894D
?
R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
[0018]優選的，所述克隆的方法為將pUC19oriKan
R
質粒分別用HindⅢ和BamHⅠ限制性內切酶酶切，將Pm889
?
894基因的上游同源臂和擴增Pm889
?
894基因的下游同源臂連接至酶切后的pUC19oriKan
R
質粒中，得到缺失基因重組質粒pUC19oriKanRΔ889
?
894。
[0019]優選的，所述轉化的方法包括電轉化；
[0020]所述電轉化的電擊電壓為2500V，電阻500歐，所述電轉化的時間為5ms。
[0021]本專利技術提供了所述牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株或所述構建方法得到的牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株在制備廣譜多殺性巴氏桿菌疫苗中的應用。
[0022]優選的，廣譜多殺性巴氏桿菌疫苗包括A型多殺性巴氏桿菌疫苗、B型多殺性巴氏桿菌疫苗和F型多殺性巴氏桿菌疫苗。
[0023]本專利技術提供了一種廣譜多殺性巴氏桿菌疫苗，包括佐劑和所述牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株或所述構建方法得到的牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株。
[0024]本專利技術提供了一種牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株，在牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2的基礎上，缺失基因組中889，890，891，892，893和894基因。本專利技術通過同源重組方式缺失牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2的基因組中889，890，891，892，893和894基因，使獲得的突變株的菌體變小，莢膜含量降低，對小鼠的致病力顯著減弱，對A型和B型多殺性巴氏桿菌具有良好的免疫保護作用，對F型多殺性巴氏桿菌菌株也能起到一定的保護作用，是制備疫苗的良好候選毒株。
[0025]同時本專利技術提供的A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株具有良好的遺傳穩定性，傳代30代后依然保持基因突變性狀，不發生回復突變。這表明本專利技術提供的A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株能夠很好的用于防治多殺性巴氏桿菌感染。
[0026]與現有技術相比，本專利技術提供的廣譜多殺性巴氏桿菌疫苗，具有以下有益效果：1)目前國內尚無商品化的有效牛源A型多殺性巴氏桿菌疫苗，該疫苗的研發，能夠有效預防牛源A型多殺性巴氏桿菌感染，減少因該病造成的養殖業經濟損失。
[0027]2)該疫苗毒性弱，穩定性好，且具有交叉保護作用，可有效防治A型、B型和F型多殺性巴氏桿菌的感染。
[0028]3)該疫苗的研發，可減少牛源A型多殺性巴氏桿菌的感染，從而降低抗生素造成的耐藥及環境污染等問題。
附圖說明
[0029]圖1為目的基因Pm889
?
984上、下游同源臂的擴增結果，其中M：DL2000的Marker；1：Pm889
?
894上游同源臂；本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株，其特征在于，在牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2的基礎上，缺失基因組中889，890，891，892，893和894基因。2.根據權利要求1所述牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株，其特征在于，889基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；890基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；891基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；892基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；893基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；894基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。3.權利要求1所述牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：以牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2的基因組DNA為模板，分別以引物Pm889
?
894U
?
F/Pm889
?
894U
?
R擴增Pm889
?
894基因的上游同源臂，用引物Pm889
?
894D
?
F/Pm889
?
894D
?
R擴增Pm889
?
894基因的下游同源臂；將所述Pm889
?
894基因的上游同源臂和擴增Pm889
?
894基因的下游同源臂克隆至pUC19oriKan
R
質粒中，得到缺失基因重組質粒pUC19oriKanRΔ889
?
894；將所述缺失基因重組質粒pUC19oriKanRΔ889
?
894轉化入PmCQ2感受態細胞中，得到PmCQ2Δ889
?
894。4.根據權利要求3所述牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2Δ889
?
894減毒株的構建方法，其特征在于，所述引物Pm889
?
894U
?
...

【專利技術屬性】
技術研發人員：彭遠義，何芳，張慧慧，李能章，
申請(專利權)人：西南大學，
類型：發明
國別省市：