本發明專利技術提供了一種檢測新型冠狀病毒的引物探針組合及其應用，所述檢測新型冠狀病毒的引物探針組合包括分別特異性擴增并檢測新型冠狀病毒的N基因和ORF1ab基因的引物對和探針；擴增所述N基因的引物對包括上游引物FP1和下游引物RP1；所述上游引物FP1包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述下游引物RP1包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；本發明專利技術中所述檢測新型冠狀病毒的引物探針組合具有很好的特異性與靈敏度。本發明專利技術還提供一種檢測新型冠狀病毒的試劑盒，所述試劑盒便于攜帶，檢測精準性高，使用時操作簡單、檢測快速、結果準確，適用于臨床分子診斷。適用于臨床分子診斷。適用于臨床分子診斷。
【技術實現步驟摘要】
一種檢測新型冠狀病毒的引物探針組合及其應用
[0001]本專利技術屬于分子生物學檢測
，尤其涉及一種檢測新型冠狀病毒的引物探針組合及其應用。
技術介紹
[0002]冠狀病毒屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬，是一類具有囊膜的RNA病毒，其基因組為線性單股正鏈，是自然界廣泛存在的一大類病毒，是目前已知的RNA病毒中基因組最大的病毒。冠狀病毒僅感染脊椎動物，與人和其他脊椎動物的多種疾病相關，可引起人和其他脊椎動物的呼吸道、消化道和神經系統的疾病。冠狀病毒分為α、β、γ和δ，總共4個屬。其中人類冠狀病毒(HCoV)有2個屬，包括α冠狀病毒(HCoV
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229E和HCoV
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NL63)和β冠狀病毒(HCoV
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HKU1、HCoV
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OC43、MERS
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CoV和SARS
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CoV)。
[0003]新型冠狀病毒屬于β屬的冠狀病毒，其基因的特征與SARS
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CoV和MERS
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CoV有明顯區別。目前研究顯示新型冠狀病毒的基因與蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat
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SL
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CoVZC45)的基因的同源性高達85％以上，人群普遍易感。
[0004]目前新型冠狀病毒的感染患者是主要的傳染源，無癥狀感染者也可能成為傳染源，經呼吸道飛沫傳播和密切接觸傳播是主要的傳播途徑，在相對封閉的環境中長時間暴露于高濃度氣溶膠，存在經氣溶膠傳播的可能。由于在糞便及尿液中可分離到新型冠狀病毒，因此，應當注意糞便及尿液對環境的污染，避免造成氣溶膠傳播或接觸傳播。基于目前的流行病學調查，人感染新型冠狀病毒后的潛伏期為1～14天，一般情況下潛伏期為3～7天。感染新型冠狀病毒后的臨床表現包括發熱、干咳和乏力。少數患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹瀉等癥狀。輕型患者僅表現為低熱、輕微乏力，無肺炎表現。重癥患者多在發病一周后出現呼吸困難和/或低氧血癥，嚴重者可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒、出凝血功能障礙及多器官功能衰竭等。值得注意的是，重型、危重型患者的病程中可能僅為中低熱，甚至無明顯發熱。部分兒童及新生兒病例癥狀不典型，表現為嘔吐和腹瀉等消化道癥狀，或者僅表現為精神弱或呼吸急促。因此，通過癥狀難以確認是否感染了新型冠狀病毒。
[0005]目前，臨床上的疑似病例需要通過實時熒光RT
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PCR檢測新型冠狀病毒核酸，疑似病例的新型冠狀病毒核酸檢測結果呈陽性，表明其感染了新型冠狀病毒，疑似病例連續兩次的新型冠狀病毒核酸檢測結果呈陰性(采樣時間至少間隔24小時)且發病7天后新型冠狀病毒特異性抗體IgM和IgG仍為陰性可排除疑似病例診斷。
[0006]因此，開發一種精確靈敏同時便攜的檢測新型冠狀病毒的試劑盒對新型冠狀病毒的檢測具有重要意義和應用前景。
技術實現思路
[0007]針對現有技術存在的不足，本專利技術的目的在于提供一種檢測新型冠狀病毒的引物探針組合及其應用。本專利技術中所述檢測新型冠狀病毒的引物探針組合具有很好的特異性與
靈敏度。本專利技術還提供一種檢測新型冠狀病毒的試劑盒，所述試劑盒便于攜帶，檢測精準性高，使用時操作簡單、檢測快速、結果準確，適用于臨床分子診斷。
[0008]為達到此專利技術目的，本專利技術采用以下技術方案：
[0009]第一方面，本專利技術提供一種檢測新型冠狀病毒的引物探針組合，所述檢測新型冠狀病毒的引物探針組合包括分別特異性擴增并檢測新型冠狀病毒的N基因和ORF1ab基因的引物對和探針；
[0010]擴增所述N基因的引物對包括上游引物FP1和下游引物RP1；
[0011]所述上游引物FP1包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
[0012]所述下游引物RP1包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
[0013]SEQ ID No.1：GTAACCAGAATGGAGAACGCAGT。
[0014]SEQ ID No.2：CTTCCTTGCCATGTTGAGTGAGA。
[0015]本專利技術中，所述N基因為核衣殼蛋白(Nucleoprotein)的編碼基因，所述ORF1ab基因為編碼SARS
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CoV
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2病毒的開放閱讀框1ab(Open reading frame1ab)的基因，這兩個基因較為保守，變異較小。通過針對N基因和ORF1ab基因設計特異性擴增的引物對及對應的探針，能夠避免因基因變異導致的檢測問題。本專利技術基于多重RT
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PCR技術，使用所述特異性擴增并檢測新型冠狀病毒的N基因和ORF1ab基因的引物對和探針可以提高檢測的精確性。
[0016]優選地，檢測所述N基因的探針包括探針P1。
[0017]優選地，所述探針P1包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0018]SEQ ID No.3：CAACGTCGGCCCCAAGGTTTACC。
[0019]優選地，所述探針P1的5
’
端修飾熒光素，所述探針P1的3
’
端修飾淬滅劑。
[0020]本專利技術中，所述探針P1的熒光素為六氯熒光素(HEX)，淬滅劑為BHQ1。
[0021]優選地，擴增所述ORF1ab基因的引物對包括上游引物FP2和下游引物RP2。
[0022]優選地，所述上游引物FP2包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
[0023]優選地，所述下游引物RP2包括SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
[0024]SEQ ID No.4：TAGTTTAGCTGCCACAGTACGTC。
[0025]SEQ ID No.5：CAGCAAAAGCACAGAAAGATAATACAGT。
[0026]優選地，檢測所述ORF1ab基因的探針包括探針P2。
[0027]優選地，所述探針P2包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
[0028]SEQ ID No.6：AATTGGCAGGCACTTCTGTTGCAT。
[0029]優選地，所述探針P2的5
’
端修飾熒光素，所述探針P2的3
’
端修飾淬滅劑。
[0030]本專利技術中，所述探針P2的熒光素為5
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羧基熒光素(FAM)，淬滅劑為BHQ1。
[0031]優選地，所述檢測新型冠狀病毒的引物探針組合還包括特異性擴增并檢測人核糖核酸酶P(RNase P)基因的引物對和探針。
[0032]本專利技術中，所述人核糖核酸酶P基因編碼人核糖核酸酶P，人核糖核酸酶P是一種核糖核蛋白，含有一個單鏈RNA分子，其長度為375個堿基，結合一個相對分子質量為20kDa的多肽。本專利技術中以人核糖核酸酶P基因為內源性內參，所述人核糖核酸酶P基因含量相對豐富、表達穩定，以其為內源性內參較為準確本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種檢測新型冠狀病毒的引物探針組合，其特征在于，所述檢測新型冠狀病毒的引物探針組合包括分別特異性擴增并檢測新型冠狀病毒的N基因和ORF1ab基因的引物對和探針；擴增所述N基因的引物對包括上游引物FP1和下游引物RP1；所述上游引物FP1包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述下游引物RP1包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。2.根據權利要求1所述的檢測新型冠狀病毒的引物探針組合，其特征在于，檢測所述N基因的探針包括探針P1；優選地，所述探針P1包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；優選地，所述探針P1的5
’
端修飾熒光素，所述探針P1的3
’
端修飾淬滅劑；優選地，擴增所述ORF1ab基因的引物對包括上游引物FP2和下游引物RP2；優選地，所述上游引物FP2包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；優選地，所述下游引物RP2包括SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；優選地，檢測所述ORF1ab基因的探針包括探針P2；優選地，所述探針P2包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；優選地，所述探針P2的5
’
端修飾熒光素，所述探針P2的3
’
端修飾淬滅劑。3.根據權利要求1或2所述的檢測新型冠狀病毒的引物探針組合，其特征在于，所述檢測新型冠狀病毒的引物探針組合還包括特異性擴增并檢測人核糖核酸酶P基因的引物對和探針；優選地，擴增所述人核糖核酸酶P基因的引物對包括上游引物FP3和下游引物RP3；優選地，所述上游引物FP3包括SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；優選地，所述下游引物RP3包括SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；優選地，檢測所述人核糖核酸酶P基因的探針包括探針P3；優選地，所述探針P3包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；優選地，所述探針P3的5
’
端修飾熒光素，所述探針P3的3
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端修飾淬滅劑。4.一種檢測新型冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，所述檢測新型冠狀病毒的試劑盒包括權利要求1～3任一項所述的檢測新型冠狀病毒的引物探針組合和反應液；優選地，所述反應液包括PCR緩沖液、酶混合液和水；優選地，所述酶混合液包括Taq酶和逆轉錄酶；優選地，所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李超，張建東，
申請(專利權)人：凡知醫療科技江蘇有限公司，
類型：發明
國別省市：
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