一種重組類人源Ⅲ型膠原蛋白及其應用制造技術

本發明專利技術提供一種重組類人源Ⅲ型膠原蛋白及其應用。根據疏水性，對人天然Ⅲ型膠原蛋白進行改造，人為篩選設計獲得類人源Ⅲ型膠原蛋白COL3A1

【技術實現步驟摘要】
一種重組類人源Ⅲ型膠原蛋白及其應用


[0001]本專利技術涉及醫藥工程領域，特別是醫美原料領域，具體涉及一種重組類人源Ⅲ型膠原蛋白及其應用。

技術介紹

[0002]膠原蛋白廣泛應用于生物、美容、食品保健等領域，并在醫藥材料領域具有巨大的應用前景，特別是在醫療領域的應用，如在燒傷治療、創傷治療、止血、眼科治療和口腔科治中，發揮非常重要的作用，同時，國外已經開始將膠原蛋白作為支架材料用于構建器官。但限制膠原蛋白應用最大的問題是膠原蛋白的來源。
[0003]目前膠原蛋白主要兩大來源，一是動物來源，主要從畜禽動物組織及海洋生物（畜禽骨頭、豬皮、海參、魚鱗、魚皮）中提取天然膠原蛋白及膠原肽，雖然過程簡便，但是存在問題：1）膠原蛋白提取效率較低，且提取的膠原蛋白分子量一般不高，同時含有較多雜質。2）受到提取工藝的限制，提取的膠原蛋白分子量在500 Da以上，再小的膠原蛋白很難提取出來。3）不同提取工藝尤其是酸法、堿法提取膠原蛋白時，會對環境造成污染，無法完全達到綠色提取。提取的膠原蛋白存在免疫原性與病原體污染的問題，多用于化妝品、食品領域。另一種獲取膠原蛋白是通過微生物發酵獲得。和直接提取相比具有很多優勢：1）產品安全，生產過程可控。原料相對明確，成分清晰，減少了病毒感染等污染風險。2）產品質量穩定，批次重復性好。采用基因工程技術表達特定的膠原蛋白分子，其成分單一，且菌株穩定性好，生產批次間差異小，產品質量穩定。3）生物相容性好，減少不必要的免疫反應。4）微生物發酵發獲取膠原蛋白生產周期相對較短，生產成本相對較低。/>[0004]目前，雖然通過動物組織提取膠原是最主要的手段，成本也較低，但是通過該方法獲得的膠原蛋白一般水溶性較差、具有潛在的病毒傳染性風險、免疫原性較高、膠原產品質量控制難度高等缺點。通過基因工程的手段制備類人源膠原蛋白分子則可以規避這些缺點，但是天然的膠原蛋白分子過大，無法或很難通過基因工程手段直接生產，而通過生產與天然膠原蛋白序列相似、分子量更小的類人源膠原蛋白分子則是在技術上更為可行。
[0005]現有技術公開了不同的重組膠原蛋白以及應用等，專利文獻1（CN100391974C，公開/公告日期2008
?
06
?
04）公開了一種重組膠原蛋白及其合成和表達純化方法，該重組膠原蛋白氨基酸序列的主體為Gly
?
Xaa
?
Yaa的三聯體，其中Xaa和Yaa中至少有一個帶電氨基酸殘基；其N末端或C末端包含半胱氨酸殘基的序列；在整個氨基酸序列中包含有Arg
?
Gly
?
Asp殘基組合。專利文獻2（CN102351954B，公開/公告日期2013
?
12
?
18）公開了一種重組膠原蛋白，其特定的氨基酸序列組成，還公開了包含該重組膠原蛋白的敷料，特別是面膜巾。專利文獻3（CN107090458A，公開/公告日期2017
?
08
?
25）公開了一種酵母重組膠原蛋白的生產方法，包括重組畢赤酵母工程菌構建及其無需甲醇誘導的組成型分泌表達重組膠原蛋白的方法，首先在基因水平上利用畢赤酵母慣用密碼子優化膠原基因序列并人工全基因合成，然后整合進酵母染色體中，構建成組成型分泌表達的重組畢赤酵母工程菌。然而，上述現有技術的重組膠原蛋白仍存在水溶性不足、保濕性效果一般等功能缺陷。
[0006]雖然，現階段市場上已有一些重組膠原蛋白產品，然而現有的產品都是針對各自產品特點需要，在人膠原蛋白序列的基礎上進行重新構建設計的，但這些設計并不能滿足膠原蛋白產品極大的水溶性和親水性、良好的保濕性和吸濕性等特殊性能需求，同時還滿足產業化制備的需要。因此，本領域亟需提供一種水溶性和親水性、保濕性和吸濕性效果優異的重組膠原蛋白產品，且制備工藝可達到工業化大規模生產，獲得的產品可滿足醫美類等化妝品領域的高標準。

技術實現思路

[0007]針對現有技術的不足，本專利技術的目的之一是提供一種人為篩選設計的重組膠原蛋白產品，該產品具有優異的水溶性和親水性，同時具有良好的保濕性、吸濕性和生物相容性，并且有促進細胞增殖、修復和抗皺緊致功效。本專利技術還提供所述重組膠原蛋白的串聯蛋白和組合物，特別是凍干粉，編碼其的核酸，包含所述核酸的載體，特別是酵母載體，包含所述核酸和載體的重組宿主細胞，特別是酵母宿主細胞。本專利技術還提供發酵表達、純化所述膠原蛋白的方法，制備凍干粉的方法，以及在制備功能性化妝品或醫美類化妝品及醫用敷料中的應用。本專利技術提供的生產、純化、制備方法，可實現低成本的工業化生產。
[0008]本專利技術進一步提供一種重組類人源Ⅲ型膠原蛋白，其特征在于，命名為COL3A1
?
QS
?
1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]本專利技術的一方面，提供一種重組類人源Ⅲ型膠原蛋白串聯蛋白，其特征在于，所述串聯蛋白的氨基酸序列由N個核心單元進行重復串聯形成，其中N是大于1的自然數，所述核心單元的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]進一步地，所述N選擇2
?
5中的任一個數值。
[0011]本專利技術的另一方面提供一種分離的核酸，其特征在于，編碼所述重組類人源Ⅲ型膠原蛋白或所述重組類人源Ⅲ型膠原蛋白串聯蛋白。
[0012]進一步地，編碼所述重組類人源Ⅲ型膠原蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0013]本專利技術的另一方面提供一種重組載體，其特征在于，包含所述的核酸。
[0014]進一步地，所述載體為酵母系統表達載體。
[0015]進一步地，所述酵母系統表達載體為pPICZα A載體或其他酵母載體，其他酵母載體包含pPIC9，pPIC9K，pHIL
?
S1，或pYAM75P載體。
[0016]本專利技術的另一方面提供一種重組宿主細胞，其特征在于，包含所述的核酸或所述的重組載體。
[0017]進一步地，所述重組宿主細胞為酵母。
[0018]進一步地，所述酵母為畢赤酵母X33，GS115，SMD1168或其他酵母菌株，其他酵母包含KM71或KM71H菌株等。
[0019]本專利技術的另一方面提供一種組合物，其特征在于，包含所述重組類人源Ⅲ型膠原蛋白或所述重組類人源Ⅲ型膠原蛋白串聯蛋白。
[0020]進一步地，所述組合物為凍干粉。
[0021]本專利技術的另一方面提供一種發酵表達制備所述重組類人源Ⅲ型膠原蛋白的方法，其特征在于，包含如下步驟：(1)種子培養；
(2)發酵培養：將種子液接種到發酵培養基中，發酵罐培養，控制適合的DO、攪拌轉速、通氣量、溫度，在適合的生長階段開始流加、誘導表達；(3)發酵上清的制備：培養至適合的時間結束培養，取發酵液去除菌體，過濾，獲得發酵上清液。
[0022]本專利技術的另一方面提供一種純化所述重組類人源Ⅲ型膠原蛋白的方法，其特征在于，包含將所述重組類人源Ⅲ型膠原蛋白的本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種重組類人源Ⅲ型膠原蛋白，其特征在于，命名為COL3A1
?
QS
?
1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一種重組類人源Ⅲ型膠原蛋白的串聯蛋白，其特征在于，所述串聯蛋白的氨基酸序列由N個核心單元進行重復串聯形成，其中N是大于1的自然數，所述核心單元的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.根據權利要求2所述的串聯蛋白，其特征在于，所述N選擇2
?
5中的任一個數值。4.一種分離的核酸，其特征在于，編碼權利要求1所述的重組類人源Ⅲ型膠原蛋白或權利要求2或3所述的重組類人源Ⅲ型膠原蛋白的串聯蛋白。5.一種重組載體，其特征在于，包含權利要求4所述的核酸。6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述載體為酵母系統表達載體。7.根據權利要求6所述的重組載體，其特征在于，所述酵母系統表達載體為pPICZα A，pPIC9，pPIC9K，pHIL
?
S1，或pYAM75P載體。8.一種重組宿主細胞，其特征在于，包含權利要求4所述的核酸或權利要求5
?
7任一項所述的重組載體。9.根據權利要求8所述的重組宿主細胞，其特征在于，所述重組宿主細胞為酵母。10.根據權利要求9所述的重組宿主細胞...

【專利技術屬性】
技術研發人員：左濤，劉立，公少華，王鵬源，王滿朝，
申請(專利權)人：江蘇耀海生物制藥有限公司，
類型：發明
國別省市：