本發明專利技術涉及重度妊娠期高血壓生化標記物的質譜試劑盒及制備方法，屬于蛋白質檢測技術領域。由磁珠、粘合液、清洗液、洗提液、穩定劑等組成，從復雜生物樣品中富集和純化多肽和蛋白。試劑盒包括一小管粘合液；一小管磁珠；一小管清洗液；一小管洗提液；一小管能量吸收分子飽和溶液的穩定劑，上述各小管置于４℃冷藏盒中。本發明專利技術可用于體外樣品檢測和預后判斷的質譜試劑盒。所述試劑盒對重度妊娠期高血壓判斷的幾個特征蛋白峰為２７７１、３２１８、３８８７、４１９２、４２１０、５１０１和５６８９Ｄａ。本方法準確、方便且快捷。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于蛋白質檢測
，特別涉及基于質譜技術的用于對重度妊娠高血 壓生物樣品中生化標記物分析的試劑盒制備方法，從復雜生物樣品中富集和純化重度妊娠 高血壓中的新型生化標記物。
技術介紹
不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白 質功能。因此，鑒定人體內表達的蛋白質的區別，可用于體外疾病樣本診斷及篩查，并最終 用于藥物開發和疾病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨 細胞內分子的復雜混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，目前用于分析蛋白 的方法在上述各方面都有局限，用這些常規手段難以進行鑒定分析。用質譜聯合可克服這 一技術缺點。妊娠高血壓疾病妊娠是特有的，表現為妊娠20周后出現血壓升高、尿蛋白及全身 各臟器功能紊亂的疾病綜合征。重度子癇前期的發病率3_5%，是引起圍產期母兒不良妊 娠結局的主要疾病之一。近年來的新研究方法包括蛋白組學、基因組學、脂質組學、mRNA 微陣列技術等，從分子學水平，深入研究妊娠高血壓疾病的發病機制，有望找到妊娠高血壓 疾病特異生化指標，成為早期診斷、監測病情及判斷疾病預后的依據。蛋白質組學是研究基 因組在不同時間和空間編碼的全部蛋白質的組成及作用規律，在組織細胞的整體蛋白質水 平上揭示生命活動的基本規律，獲得對細胞生理、病理過程及調控網絡的全面而深入的認 識。應用的技術平臺主要有二維凝膠電泳分離技術和質譜分析技術。前者主要用于分子 量IO-IOOkD蛋白質分離，對于疏水性、低豐度、低含量的蛋白質難以檢出。而質譜儀可實現 IOkD以下小分子、低含量，尤其是組織細胞內的微量調控蛋白質的分離鑒定。蛋白質指紋 圖譜技術是一種新的蛋白質分離、鑒定方法。其原理是利用激光脈沖輻射使蛋白質芯片池 中的分析物解吸形成荷電離子，不同質荷比的離子在儀器場中飛行的時間長短不一，經軟 件處理后，精確的繪制出蛋白質譜圖。其優點是可直接從原始樣品中進行捕獲、檢測與分 析，靈敏度高，檢測范圍廣(500 500000)，所需樣品體積小(0. 5 400 μ L)；檢測簡便， 整個測定過程一般為30min，且敏感性和特異性高；同時不會破壞所測定的蛋白質；結果可 靠，可重復性高。該技術不僅可篩選出與疾病相關的特異生物標志物，還可發現與疾病相關 的不同方式組合的蛋白質指紋圖譜，為疾病的臨床早期診斷、藥靶的發現、療效判斷和預后 提供了依據。目前在進行蛋白質質譜分析時還沒有發現一個用于重度妊娠高血壓生化標記物 檢測的標準化質譜試劑盒。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服已有技術的不足之處，提出一種用于檢測臨床重度妊娠高血 壓生化標記物的質譜試劑盒及制備方法，該試劑盒為重度妊娠高血壓的早期檢測提供了新3的途徑，并為進一步發現新的重度妊娠高血壓生物標志提供了基礎。本專利技術提出的用于檢測重度妊娠高血壓生物標志的質譜試劑盒，其特征在于，該 試劑盒包括一小管粘合液，10 30 μ 1 ；一小管質譜標準化質控血清(漿)，10 30 μ 1 ；一小管MB-WCX磁珠或金屬親和表面(MB-IMAC Fe)磁珠30 50 μ 1 ；一小管清洗液300 500 μ 1，該清洗液為50 IOOmM PBS或NaAc，ρΗ值為4. 0 5. 0 ；。一小管洗提液10 50 μ 1，該洗提液為1 5%三氟乙酸的水溶液；一小管穩定劑5 10μ 1，該穩定劑由能量吸收分子溶解在含30 60%乙腈和 0.5 三氟乙酸的水溶液中構成，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥 基苯甲酸之中的任一種；上述各小管置于4°C冷藏盒中。本專利技術提出的上述質譜試劑盒制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1)含粘合液的質譜標準化質控血清(漿)的制備將男性、女性等量的0型血 清(漿)稀釋在粘合液中制成質譜的標準化質控血清(漿)，加10%牛胰島素(bovine insulin，5733Da)，并將該稀釋的血清(漿)分裝成10 30 μ 1小管中；其中，血清(漿) 粘合液=1 2，所述粘合液為 9Μ Urea, 2% CHAPS, 50mM Tris-HCL, ρΗ 7· 0 9· 0 ；2)將購買的 50 IOOmM PBS (Phosphate-Buffered Saline)或 NaAc，ρΗ 值為 4.0 5.0清洗液、1 5%三氟乙酸的洗提液分別分裝成300 500 μ 1小管和10 50 μ 1 小管；3)將能量吸收分子溶解30 60%乙腈和0. 5 1 %三氟乙酸的水溶液中制成穩 定劑，并分裝成5 10 μ 1小管，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲 酸之中的任一種；4)將上述分裝好的各小管置于4°C冷藏箱中。本專利技術還提出所述的試劑盒對重度妊娠高血壓生物標志的預后判斷的應用。所述試劑盒依據幾個特征蛋白峰為2771、3218、3887、4192、4210、5101和 5689Da(圖1)，雙盲測試重度妊娠高血壓生物標志樣品的敏感性100%，特異性為100%。質譜試劑盒檢測重度妊娠高血壓生物標志的應用實驗步驟包括1.將生物樣品先用粘合液稀釋30 50倍，將樣品充分混勻；2.將上述標本100 μ 1加至已裝好磁珠的PCR管中，置磁性處理器上，15 25°C孵 育20 40分鐘，除去液體；3.加100 μ 1清洗液至已裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育1 5分鐘，除 去液體，重復上述操作兩次；4.加10 μ 1洗提液1 5分鐘，洗脫標本至上清液；5.取5 μ 1上清液移至另一個PCR管中，加入5 μ 1能量吸收分子飽和穩定劑充分 混勻；6.取1 μ 1混合溶液加樣至質譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬47.將上述金屬片加入質譜儀中，就會生成質譜；8.外部使用多肽分子質量標準來校正質量精確性，所有樣本均進行雙份檢測以減 少實驗誤差。上述的生物標志是利用一臺質譜儀來檢測的。該設備的質量精確度約為+/_1%。重度妊娠高血壓生物標志首先能夠被具有能與重度妊娠高血壓生物標志結合的 磁珠(Magnetic Bead，簡稱MB，如MB_WCX、MB_IMAC Fe等品名)吸附表面捕獲，非吸附物能 從磁珠上洗脫，吸附到磁珠底基的重度妊娠高血壓生物標志在質譜儀中被檢測。重度妊娠 高血壓生物標志通過離子發生源，如激光，被離子化，產生的離子被一個離子感受集合器收 集，然后質量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉換為質荷比。 定量性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血 清中用于定量的標準峰bovine insulin，5733Da強度調至50%質譜信號強度的最大值。重 度妊娠高血壓生物標志的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關。這樣，重度妊娠高血壓生 物標志的數量與質量都可以被檢測出來。質譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子 化能量攻擊一個樣本產生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干 擾，并增加了動態范圍。該飛行時間數據受數據處理軟件的影響。軟件中數據處理主要包 括轉換飛行時間與質荷比而產生質譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而 減輕高頻噪音。通過對重度妊娠高本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測重度妊娠期高血壓生化標記物的質譜試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括： 一小管粘合液，１０～３０μｌ； 一小管質譜標準化質控血清（漿），１０～３０μｌ； 一小管ＭＢ－ＷＣＸ磁珠或金屬親和表面（ＭＢ－ＩＭＡＣ Ｆｅ）磁珠３０～５０μｌ； 一小管清洗液３００～５００μｌ，為５０～１００ｍＭ ＰＢＳ或ＮａＡｃ，ｐＨ優化值為４．０～５．０； 一小管洗提液１０～５０μｌ，該洗提液為１～５％三氟乙酸的水溶液； 一小管穩定劑５～１０μｌ，該穩定劑由能量吸收分子溶解在含３０～６０％乙腈和０．５～１％三氟乙酸的水溶液中構成，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；上述各小管置于４℃冷藏盒中。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：邊旭明，劉俊濤，許洋，
申請(專利權)人：許洋，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]
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