油菜未成熟小孢子胚直接萌發(fā)成植株的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種未成熟小孢子胚直接萌發(fā)成植株的制備方法，首先是小孢子的制備，選取小孢子的新鮮花蕾，消毒，無菌水洗去消毒液，在培養(yǎng)基中擠壓花蕾．過篩、離心收集小孢子；其次是小孢子的誘導(dǎo)，用培養(yǎng)基調(diào)小孢子密度，恒溫培養(yǎng)；第三是小孢子胚的選擇，選擇一定長(zhǎng)度未分化完全的胚：第四是小孢子胚的萌發(fā)，將未分化完全的胚的根插入固體培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)一定時(shí)間后形成植株。本方法操作簡(jiǎn)單，萌發(fā)頻率高，可廣泛應(yīng)用于植物育種和科學(xué)研究。（*該技術(shù)在2022年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地說，本專利技術(shù)涉及一種未成熟小孢子胚直接萌發(fā)成植株的制備方法。
技術(shù)介紹
植物小孢子又叫幼嫩花粉是一種單倍性，單細(xì)胞的群體。在體外通過組織培養(yǎng)可誘導(dǎo)小孢子脫分化，啟動(dòng)胚性分裂形成胚。目前，小孢子(花粉)胚胎發(fā)生已在25個(gè)科，50個(gè)屬，近200個(gè)種中取得了成功(Ferrie AMR，Palmer CE，KellerWA.，Haploid embryogenesis.InThorpe TA(ed)In vitro embryogenesis.In plants.Kluwer Academic Publishers，Dordrecht.，1995.309-344.)。與其它體外胚胎發(fā)生體系相比，由小孢子發(fā)育而來的胚狀體具有個(gè)體形態(tài)更為一致，發(fā)生量大，結(jié)構(gòu)完整等優(yōu)點(diǎn)，而且其具單倍體的遺傳背景，經(jīng)自發(fā)或人工加倍后，即可獲得純合的二倍體，因而在無性系快速繁殖，植物遺傳工程和品種改良等方面的應(yīng)用價(jià)值都受到高度重視(Ragharan V.，Embryogenenic Development of Pollen Grains.InRagharan V(ed)Molecular embryology of flowering plants.New YorkCambridgeUniversity Press，1997.500-524.)。然而其應(yīng)用潛力在很大程度上要受到花粉胚狀體直接萌發(fā)困難，或者萌發(fā)率不夠高的限制。這主要是由于胚狀體萌發(fā)過程中存在一個(gè)問題，即接種的胚狀體直接萌發(fā)受到抑制，通常需要二次成胚或愈傷化后通過器官發(fā)生再生小植株。按照常規(guī)的方法，將油菜小孢子胚狀體接種于B5培養(yǎng)基上，只有極少數(shù)(5-7.8％)從分生組織處正常萌發(fā)，直接再生小植株，大多數(shù)胚狀體在培養(yǎng)基上先愈傷化，再二次成胚，或通過器官發(fā)生形成小植株(Chuong PV，Beversdorf WD.High frequency embryogenesis through isolatedmicrospore culture in Brassica napus L.and B.carinata Braun.Plant Sci，1985，39219-226；Swanson EB，Coumans MP，Wu SC，Barsby TL，Beversdorf WD.Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryosfrom Brassica napus.Plant Cell Rep，1987，694-97；Cao MQ，Li Y，Liu F，Dore C.Embryogenesis and plant regeneration of pakchio(Brassica rapa L.ssp.Chinensis)via in vitro isolated microspore culture.Plant Cell Rep，1994，13447-450)。同時(shí)，在其萌發(fā)和生長(zhǎng)中，常出現(xiàn)分生組織缺乏，早期壞死，多子葉等不正?，F(xiàn)象(CaoMQ，Li Y，Liu F，Dore C.Embryogenesis and plant regeneration of pakchio(Brassicarapa L.ssp.Chinensis)via in vitro isolated microspore culture.Plant Cell Rep，1994，13447-450)。Senaratna T等(1991)將油菜(B.napus.L)子葉期的小孢子胚先在50mM的ABA處理7天后，再于低于15％的濕度下干化處理至少7天，獲得了較好的萌發(fā)效果，直接萌發(fā)頻率可達(dá)50％(Senaratna T，Kott L，BeversdorfWD.Mckersie BD.Desiccation of microspore derived embryos of oilseed rapa(Brassica rapa L.).Plant Cell Rep，1991，10342-344.)。但此法復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，且萌發(fā)頻率仍不能滿足要求。通常用于萌發(fā)實(shí)驗(yàn)的胚為充分分化的成熟胚，未成熟胚的直接萌發(fā)則難度更大。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種未成熟小孢子胚直接萌發(fā)成植株的制備方法，該方法解決未成熟小孢子胚難以直接萌發(fā)成苗的技術(shù)難題，可使85％以上的小孢子胚直接萌發(fā)成植株。根據(jù)本專利技術(shù)提供的方法并使用本專利技術(shù)提供的培養(yǎng)基可實(shí)現(xiàn)上述目的。一種小孢子胚萌發(fā)成植株的方法，該方法包括以下步驟1、小孢子的制備選取小孢子處于單核晚期的新鮮花蕾，消毒，無菌水洗去消毒液，在B5培養(yǎng)基中輕輕擠壓花蕾，使小孢子游離個(gè)培養(yǎng)基中，過篩除花蕾組織殘?jiān)?，離心收集小孢子；2、小孢子胚的誘導(dǎo)用NLN-13培養(yǎng)基調(diào)小孢子密度至1-2×105/mL，分裝小孢子于培養(yǎng)皿中，32℃恒溫暗培養(yǎng)14天，移至25℃，2-10μmol·s-1·m-2，培養(yǎng)8-11天，再用NLN-0培養(yǎng)基稀釋至300-400胚狀體/3.5cm培養(yǎng)皿，弱光培養(yǎng)10-16天，形成未成熟小孢子胚；3、小孢子胚的選擇用于萌發(fā)的小孢子胚是剛生根，或還未生根，下胚軸較短，長(zhǎng)度小于5mm未分化完全的胚；4、小孢子胚的萌發(fā)將未分化完全的胚插入含氯化鈣和硝酸銨的MS固體培養(yǎng)基中，在28-35℃恒溫光照為2-10μmol·st-1·m-2時(shí)培養(yǎng)16-18天形成植株，其中未成熟小孢子胚的培養(yǎng)基的組成是(以下簡(jiǎn)稱WH-2培養(yǎng)基)(以1000毫升計(jì))MS常用培養(yǎng)基500毫升水 500毫升氯化鈣 300-600毫克硝酸銨 80-120毫克硫胺(維生素B1) 2-6毫克維生素H 0.04-0.06毫克葉酸0.4-0.6毫克維生素B60.8-1.2毫克煙堿酸 4-6毫克氨基乙酸 1-3毫克谷氨酰胺 6-10毫克天冬酰胺 3-5毫克蔗糖 20-30毫克瓊脂 6-10毫克調(diào)PH至5.3-6.0在本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選方案中，由小孢子萌發(fā)成植株的方法包括以下步驟1、孢子的制備選取小孢子處于單核晚期的新鮮花蕾，消毒，無菌水洗去消毒液，在B5培養(yǎng)基中輕輕擠壓花蕾，使小孢子游離至培養(yǎng)基中，過篩除花蕾組織殘?jiān)?，離心收集小孢子；2、小孢子胚的誘導(dǎo)用NLN-13培養(yǎng)基調(diào)小孢子密度至1-2×105/mL，分裝小孢子于培養(yǎng)皿中，32℃恒溫暗培養(yǎng)14天，移至25℃光照為2-10μmol·s-1·m-2時(shí)培養(yǎng)10天，再用NLN-0培養(yǎng)基稀釋至300-400胚狀體/3.5cm培養(yǎng)皿，弱光培養(yǎng)15天，形成小孢子胚；3、小孢子胚的選擇用于萌發(fā)的小孢子胚是剛生根，或還未生根，下胚軸較短，長(zhǎng)度小于5mm未分化完全的胚；4、小孢子胚的萌發(fā)將未分化完全的胚插入含氯化鈣和硝酸銨的MS固體培養(yǎng)基中，在32℃恒溫光照為2-10μmol·s-1·m-2時(shí)培養(yǎng)30天形成植株，其中未成熟小孢子胚的培養(yǎng)基的組成是(WH-2)(以1000毫升計(jì))MS常用培養(yǎng)基 500毫升水500毫升氯化鈣300-600毫克硝酸銨100毫克硫胺(維生素B1)4毫克維生素H 0.05毫克葉酸 0.本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種未成熟小孢子胚直接萌發(fā)成植株的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟：Ａ、小孢子的制備：選取小孢子處于單核晚期的新鮮花蕾，消毒，無菌水洗去消毒液，在Ｂ５培養(yǎng)基中輕輕擠壓花蕾，使小孢子游離至培養(yǎng)基中，過篩除花蕾組織殘?jiān)?，離心收集小孢子 ；Ｂ、小孢子胚的誘導(dǎo)：用ＮＬＮ－１３培養(yǎng)基調(diào)小孢子密度至１－２×１０↑［５］／ｍＬ，分裝小孢子于培養(yǎng)皿中，３２℃恒溫暗培養(yǎng)１４天，移至２５℃，２－１０μｍｏｌ.ｓ↑［－１］.ｍ↑［－２］，培養(yǎng)８－１１天，再用ＮＬＮ－０培養(yǎng)基稀釋至３００ －４００胚狀體／３．５ｃｍ培養(yǎng)皿，弱光培養(yǎng)１０－１６天，形成未成熟小孢子胚；Ｃ、小孢子胚的選擇：用于萌發(fā)的小孢子胚是剛生根，或還未生根，下胚軸較短，長(zhǎng)度小于５ｍｍ未分化完全的胚；Ｄ、小孢子胚的萌發(fā)：將未分化完全的胚的根插入含附加氯化 鈣和硝酸銨的ＭＳ固體培養(yǎng)基中，在２８－３５℃恒溫，在光照為２－１０μｍｏｌ.ｓ↑［－１］.ｍ↑［－２］時(shí)，培養(yǎng)１２－１６天形成植株，其中未成熟小孢子坯的培養(yǎng)基的組成是：ＭＳ常用培養(yǎng)基 ５００毫升水 ５００毫升氯化鈣 ３００－６０ ０毫克硝酸銨 ８０－１２０毫克硫胺（維生素Ｂ１） ２－６毫克維生素Ｈ ０．０４－０．０６毫克葉酸 ０．４－０．６毫克維生素Ｂ６ ０．８－１．２毫克煙堿酸 ４－６毫克氨基乙酸 １－３毫克谷氨酰胺 ６－１０毫克 天冬酰胺 ３－５毫克蔗糖 ２０－３０毫克瓊脂 ６－１０毫克調(diào)ＰＨ至５．３－６．０。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種未成熟小孢子胚直接萌發(fā)成植株的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟A、小孢子的制備選取小孢子處于單核晚期的新鮮花蕾，消毒，無菌水洗去消毒液，在B5培養(yǎng)基中輕輕擠壓花蕾，使小孢子游離至培養(yǎng)基中，過篩除花蕾組織殘?jiān)?，離心收集小孢子；B、小孢子胚的誘導(dǎo)用NLN-13培養(yǎng)基調(diào)小孢子密度至1-2×105/mL，分裝小孢子于培養(yǎng)皿中，32℃恒溫暗培養(yǎng)14天，移至25℃，2-10μmol·s-1·m-2，培養(yǎng)8-11天，再用NLN-0培養(yǎng)基稀釋至300-400胚狀體/3.5cm培養(yǎng)皿，弱光培養(yǎng)10-16天，形成未成熟小孢子胚；C、小孢子胚的選擇用于萌發(fā)的小孢子胚是剛生根，或還未生根，下胚軸較短，長(zhǎng)度小于5mm未分化完全的胚；D、小孢子胚的萌發(fā)將未分化完全的胚的根插入含附加氯化鈣和硝酸銨的MS固體培養(yǎng)基中，在28-35℃恒溫，在光照為2-10μmol·s-1·m-2時(shí)，培養(yǎng)12-16天形成植...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫蒙祥，田輝，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：武漢大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：83[中國(guó)|武漢]