【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物治療領域，具體涉及一種gsk-3β抑制劑的制備方法。
技術介紹
1、糖原合成酶激酶-3β（gsk-3β）是一種在哺乳動物體內廣泛存在的具有嚴格進化保守性的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠參與包括糖代謝、細胞信號、細胞增殖、細胞分化、細胞周期、胚胎發育、細胞凋亡、胰島素應答以及多種組織器官調節因子在內的多種生理過程，并且在癌癥、糖尿病、阿爾茲海默癥和炎癥等多種病理過程中發揮關鍵作用。
2、在dna損傷、缺氧等多種情況下，gsk-3β能夠誘發細胞凋亡，然而對于腫瘤而言gsk-3β的作用是多重的。例如，gsk-3β在卵巢癌、前列腺癌等癌癥病理過程中可以通過抑制性激素受體發揮抑制癌細胞增長的作用；而gsk-3β同樣能夠促進胰腺癌細胞、結腸癌細胞的存活，起到促進疾病進程的作用。因此，科研工作者們正在對以gsk-3β為靶點的疾病通路展開深入的研究工作，以期在多種疾病的治療領域帶來突破。
3、cp21r7是目前實驗室中應用最為廣泛的gsk-3β抑制劑之一，廣泛應用于gsk-3β或pkc等通路相關領域的研究工作之中。同時，cp21r7還能誘導激活wnt信號通路，可用作干細胞激活劑，誘導干細胞分化。cp21r7對gsk-3β具有很強的選擇性抑制作用，ic50約為1.8nm。與已經開發的許多可逆抑制劑相比，gsk-3β的共價抑制劑顯著缺乏，因此cp21r7的作用便更加凸顯。
4、目前主要通過化學合成制備cp21r7，具體反應路線如下：
5、
6、但是上述cp21r7的反應路線存在
技術實現思路
1、專利技術目的：針對上述的合成cp21r7的現有技術存在的合成產率不高、存在化學污染和殘留等問題，本專利技術公開了一種gsk-3β抑制劑的制備方法。
2、本專利技術改造了放線菌chromobacterium?violaceum的血紅素依賴性氧化酶，得到了一種關鍵合成酶cv1218，并利用pmlaad蛋白和marc蛋白與關鍵合成酶合作制備cp21r7，以解決目前cp21r7制備方法中存在的合成產率不高、存在化學污染和殘留等問題。
3、技術方案：一種gsk-3β抑制劑的制備方法，步驟如下：
4、步驟一、關鍵合成酶的合成和表達載體的構建
5、（11）對放線菌chromobacterium?violaceum的血紅素依賴性氧化酶進行結構改造得到關鍵合成酶cv1218，關鍵合成酶cv1218的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；
6、（12）利用gibson拼接克隆技術，將關鍵合成酶cv1218的基因片段克隆到載體pmcsg10中得到表達載體pmcsg10-cv1218，將基因片段pmlaad克隆到載體pet28a(+)中得到表達載體pet28a(+)-pmlaad，將基因片段marc克隆到載體pet26b中得到表達載體pet26b-marc，其中：
7、基因片段pmlaad的氨基酸序列如seq?id?no.2所示；
8、基因片段marc的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；
9、（13）將構建好的表達載體pet28a(+)-pmlaad、表達載體pmcsg10-cv1218、表達載體pet26b-marc分別轉化到感受態細胞bl21(de3)中得到菌種溶液，分別于-80℃保存；
10、步驟二、關鍵合成酶的表達
11、（21）制備pmlaad蛋白粗制裂解液；
12、（22）制備cv1218蛋白粗制裂解液；
13、（23）制備marc蛋白粗制裂解液；
14、步驟三、酶促反應體系的搭建
15、（31）向反應容器中依次加入下列物質：
16、
17、（32）混勻后，震蕩反應6-8h，震蕩反應全程保持反應容器為敞口狀態；
18、（33）分別向反應容器中加入600ml?marc蛋白粗制裂解液、2.1gα-酮戊二酸、1.32g抗壞血酸、適量的硫酸亞鐵，使得硫酸亞鐵在菌液中的濃度為0.1mm，混勻后，繼續震蕩反應2h得到反應液；
19、步驟四、產物的分離
20、將步驟三得到的反應液進行后處理，完成后即得到gsk-3β抑制劑。
21、進一步地，步驟（21）的具體步驟如下：
22、（211）取10μl的pet28a(+)-pmlaad菌種溶液，加入到5ml的lb液體培養基中，37℃、200rpm震蕩過夜培養，得到pet28a(+)-pmlaad種子液，其中：
23、lb液體培養基中含卡那霉素，其濃度為50μg/ml；
24、（212）將步驟（211）得到的pet28a(+)-pmlaad種子液全部加入到含1l的lb液體培養基的試驗容器中，然后在搖床內以37℃、200rpm震蕩培養，至菌液中含pmlaad表達載體的菌液濃度od600=1.1-1.3為止，隨后將試驗容器取出并置于冰浴中30min，其中：
25、lb液體培養基中含卡那霉素，其濃度為50μg/ml；
26、（213）向經過步驟（212）處理的菌液中加入適量的iptg，使得iptg在菌液中的濃度為0.1mm，混勻后放入搖床內以18℃、200rpm誘導培養16h；
27、（214）將經過步驟（213）誘導完畢的菌液倒入離心杯，4000g離心15min，棄上清液，沉淀表面用ddh2o清洗，隨后加入30ml上樣緩沖液將沉淀菌體重懸至無明顯菌塊得到菌體重懸液，其中：
28、所述上樣緩沖液的ph值為8.0；
29、所述上樣緩沖液包括：100mm?tris-hcl、300mm?nacl、5mm咪唑、10%v/v甘油，余量為水；
30、（215）利用超生破碎儀將步驟（214）得到的菌體重懸液破碎，得到破碎后的菌液，其中：
31、變幅桿直徑為6mm；
32、破碎程序為：能量40%，超聲循環工作時間2s、暫停時間4s，工作總時間30min；
33、（216）將破碎后的菌液以10000g低溫離心15min，取上清液，即得到pmlaad蛋白粗制裂解液。
34、進一步地，步驟（22）的具體步驟如下：
35、（221）取10μl的pmcsg10-cv1218菌種溶液，加入到5ml的lb液體培養基中，37℃、200rpm震蕩過夜培養，得到pet26b-cv1218種子液，其中：
36、lb液體培養基中含氨芐青霉素，其濃度為50μg/ml；
37、（222）將步驟（221）得到的pmcsg10-cv1218種子液加入到含1l的lb液體培養基的試驗容器中，在搖床內以37℃、20本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種GSK-3β抑制劑的制備方法，其特征在于，步驟如下：
2.如權利要求1所述的一種GSK-3β抑制劑的制備方法，其特征在于，步驟（21）的具體步驟如下：
3.如權利要求1所述的一種GSK-3β抑制劑的制備方法，其特征在于，步驟（22）的具體步驟如下：
4.如權利要求1所述的一種GSK-3β抑制劑的制備方法，其特征在于，步驟（23）的具體步驟如下：
5.如權利要求1所述的一種GSK-3β抑制劑的制備方法，其特征在于，步驟（31）中所述NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液的濃度為1M，pH值為8.0；
6.如權利要求1所述的一種GSK-3β抑制劑的制備方法，其特征在于，步驟（4）中的后處理的具體步驟如下：
【技術特征摘要】
1.一種gsk-3β抑制劑的制備方法，其特征在于，步驟如下：
2.如權利要求1所述的一種gsk-3β抑制劑的制備方法，其特征在于，步驟（21）的具體步驟如下：
3.如權利要求1所述的一種gsk-3β抑制劑的制備方法，其特征在于，步驟（22）的具體步驟如下：
4.如權利要求1所述的一種gsk-3β抑制劑...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孟雨晴，李巖，王繼剛，朱永平，劉艷青，張珺哲，谷麗維，馬昂，張昕煒，
申請(專利權)人：中國中醫科學院中藥研究所，
類型：發明
國別省市：
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