Taq DNA聚合酶抗體及其組合物、其修飾的Taq DNA聚合酶及其應用制造技術

本發明專利技術涉及抗體技術領域，具體涉及Taq?DNA聚合酶抗體及其組合物、其修飾的Taq?DNA聚合酶及其應用。本發明專利技術提供的Taq?DNA聚合酶抗體或其抗原結合片段能夠與Taq?DNA聚合酶結合，具有較高的親和力，可用于修飾Taq?DNA聚合酶制備熱啟動Taq?DNA聚合酶，在低溫時抗體能夠封閉Taq?DNA聚合酶的活性位點，高溫時抗體失活，Taq?DNA聚合酶活性釋放，能夠有效減少PCR中的非特異性擴增和引物二聚體的產生，提高目的片段的擴增效率和擴增特異性，且抗體修飾的Taq?DNA聚合酶具有較好的儲存穩定性和熱穩定性，在核酸擴增和檢測領域具有較好的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及抗體，尤其涉及taq?dna聚合酶抗體及其組合物、其修飾的taq?dna聚合酶及其應用。

技術介紹

1、聚合酶鏈式反應（polymerase?chain?reaction，pcr）是利用dna在體外高溫條件下變性解鏈形成單鏈，低溫條件下引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，當溫度為dna聚合酶最適反應溫度時，dna聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互補鏈。pcr通過模板dna變性、模板dna與引物退火、引物的延伸等步驟，經多次循環得到目的片段，dna聚合酶是實現dna復制的關鍵。

2、taq?dna聚合酶是從水生棲熱菌yt-1分離的耐熱dna聚合酶。然而，在pcr反應體系中，低溫條件下taq?dna聚合酶仍有活性，導致堿基互補配對，進而容易產生非特異性擴增和引物二聚體。為解決該問題，現有技術通過蠟隔絕法、基因突變、化學修飾、抗體修飾、核酸適配體或共價鍵結合修飾taq?dna聚合酶，即通過控制taq?dna聚合酶在高溫條件下才具有活性，克服原有taq?dna聚合酶的缺陷。

3、利用熱啟動taq?dna聚合酶進行擴增是提高pcr擴增特異性、提升擴增靈敏度的主要方法。熱啟動taq?dna聚合酶的修飾方法主要包括化學修飾、抗體修飾、蛋白修飾以及配體肽修飾，或者多種修飾方法混合使用以達到對taq?dna聚合酶活性的封閉作用，常溫或者低溫條件下，taq?dna聚合酶活性被封閉，大量減少非特異性反應，保持酶活穩定性，再通過95℃高溫使封閉酶活的物質脫落、失活，釋放taq?dna聚合酶活性，從而達到熱啟動效果。采用肝素、酸酐類物質進行化學修飾通常通過共價鍵方式結合taq?dna聚合酶，高溫條件下肝素脫落，啟動酶活性，低溫條件下則繼續結合taq?dna聚合酶以封閉活性。此類熱啟動taqdna聚合酶的主要缺點是需要15min左右持續高溫才能徹底使酶活性恢復，因此導致模板的高溫降解。抗體修飾、蛋白修飾以及肽修飾是通過非共價鍵結合taq?dna聚合酶的活性位點，高溫使抗體、蛋白、肽等配體失活，達到實時熱啟動，然而目前此類熱啟動taq?dna聚合酶或存在抗體與taq?dna聚合酶的親和力較低，活性位點的封閉效果較差的問題，或存在抗體穩定性差，容易出現抗體失活、封閉效果減弱的問題。

技術實現思路

1、本專利技術提供taq?dna聚合酶抗體及其組合物、其修飾的taq?dna聚合酶及其應用。

2、本專利技術通過利用taq?dna聚合酶作為免疫原免疫動物、經細胞融合和篩選，得到了兩株雜交瘤細胞株2c11與6b9及其產生的單克隆抗體2c11和6b9。利用上述抗體修飾taqdna聚合酶，可以在低溫時使taq?dna聚合酶的活性位點被封閉，單獨每個抗體修飾均具有較好的封閉效果，且兩個抗體組合封閉時，封閉效果明顯優于每個抗體；當溫度升高時，抗體失活，taq?dna聚合酶活性釋放，發揮熱啟動的作用，用于pcr能夠有效減少非特異性擴增和引物二聚體的產生；而且，本專利技術的抗體修飾taq?dna聚合酶具有較高的穩定性，經儲存后仍具有較好的熱啟動以及降低非特異性擴增和引物二聚體的效果。

3、具體地，本專利技術提供以下技術方案：

4、第一方面，本專利技術提供taq?dna聚合酶抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的互補決定區cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.1所示、cdr2的氨基酸序列為aas，cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，重鏈可變區的互補決定區cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分別如seq?id?no.3、4、5所示。

5、優選地，所述抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的氨基酸序列如seq?id?no.9所示或與如seq?id?no.9所示序列具有至少80%的相似性，重鏈可變區的氨基酸序列如seqid?no.10所示或與如seq?id?no.10所示序列具有至少80%的相似性。

6、在本專利技術的一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的氨基酸序列如seq?id?no.9所示，重鏈可變區的氨基酸序列如seq?id?no.10所示。

7、本專利技術提供的上述抗體能夠與taq?dna聚合酶結合，具有較高的親和力，上述抗體與taq?dna聚合酶結合后，在低溫時能夠封閉taq?dna聚合酶的活性位點，高溫時抗體失活，taq?dna聚合酶活性釋放，實現熱啟動效果，能夠有效減少pcr中的非特異性擴增和引物二聚體的產生，提高目的片段的擴增效率和擴增特異性，且抗體結合的taq?dna聚合酶具有較高的儲存穩定性和較好的熱穩定性。

8、優選地，所述抗體或其抗原結合片段為單克隆抗體、fab、fab'、f(ab')2、fv、單鏈抗體或多特異抗體。

9、在本專利技術的一些實施方式中，所述抗體為單克隆抗體。所述抗體還包含恒定區序列。所述恒定區序列選自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd的恒定區序列。所述恒定區可為鼠的igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd的恒定區。

10、第二方面，本專利技術提供編碼所述抗體或其抗原結合片段的核酸分子。

11、根據上述抗體或其抗原結合片段的氨基酸序列，本領域技術人員可獲得編碼上述抗體或其抗原結合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密碼子的簡并性，編碼上述抗體或其抗原結合片段的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能夠編碼產生上述抗體或其抗原結合片段的核酸分子均在本專利技術的保護范圍內。

12、在本專利技術的一些實施方式中，編碼所述抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no.13所示，編碼所述抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no.14所示。

13、第三方面，本專利技術提供含有所述核酸分子的生物材料；所述生物材料為表達盒、載體或宿主細胞。

14、上述表達盒可通過在所述核酸分子的上游連接啟動子等轉錄或翻譯調控元件和/或在其下游連接終止子等轉錄或翻譯調控元件得到。

15、上述載體包括但不限于質粒載體、噬菌體載體、病毒載體、人工染色體載體等。

16、上述宿主細胞包括微生物細胞、昆蟲細胞或其它動物細胞。

17、第四方面，本專利技術提供抗體偶聯物，其為將所述taq?dna聚合酶抗體或其抗原結合片段與標記物偶聯得到，所述標記物選自酶標記、生物素標記、熒光染料標記、化學發光染料標記、放射性標記中的一種或多種。

18、第五方面，本專利技術提供taq?dna聚合酶的抗體組合物，所述抗體組合物包含以下（1）和（2）中的抗體：

19、（1）輕鏈可變區的互補決定區cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.1所示、cdr2的氨基酸序列為aas，cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，重鏈可變區的互補決定區cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分別如seq?id?no.3、4、5所示本文檔來自技高網...

【技術保護點】

1.Taq?DNA聚合酶抗體或其抗原結合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的互補決定區CDR1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示、CDR2的氨基酸序列為AAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，重鏈可變區的互補決定區CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO.3、4、5所示。

2.根據權利要求1所述的Taq?DNA聚合酶抗體或其抗原結合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.9所示或與如SEQ?ID?NO.9所示序列具有至少80%的相似性，重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.10所示或與如SEQID?NO.10所示序列具有至少80%的相似性。

3.根據權利要求1或2所述的Taq?DNA聚合酶抗體或其抗原結合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結合片段為單克隆抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、單鏈抗體或多特異抗體。

4.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼權利要求1~3任一項所述的Taq?DNA聚合酶抗體或其抗原結合片段。

5.生物材料，其特征在于，所述生物材料含有權利要求4所述的核酸分子；

6.Taq?DNA聚合酶的抗體組合物，其特征在于，所述抗體組合物包含以下（1）和（2）中的抗體：

7.權利要求1~3任一項所述的Taq?DNA聚合酶抗體或其抗原結合片段或權利要求4所述的核酸分子或權利要求5所述的生物材料或權利要求6所述的Taq?DNA聚合酶的抗體組合物的如下任一種應用：

8.一種熱啟動Taq?DNA聚合酶，其特征在于，所述熱啟動Taq?DNA聚合酶包含Taq?DNA聚合酶，還包含權利要求1~3任一項所述的Taq?DNA聚合酶抗體或其抗原結合片段或權利要求6所述的Taq?DNA聚合酶的抗體組合物。

9.權利要求8所述的熱啟動Taq?DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述方法包括：采用權利要求1~3任一項所述的Taq?DNA聚合酶抗體或其抗原結合片段或權利要求6所述的Taq?DNA聚合酶的抗體組合物修飾Taq?DNA聚合酶。

10.權利要求8所述的熱啟動Taq?DNA聚合酶的以下任一種應用：

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【技術特征摘要】

1.taq?dna聚合酶抗體或其抗原結合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的互補決定區cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.1所示、cdr2的氨基酸序列為aas，cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，重鏈可變區的互補決定區cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分別如seq?id?no.3、4、5所示。

2.根據權利要求1所述的taq?dna聚合酶抗體或其抗原結合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的氨基酸序列如seq?id?no.9所示或與如seq?id?no.9所示序列具有至少80%的相似性，重鏈可變區的氨基酸序列如seq?id?no.10所示或與如seqid?no.10所示序列具有至少80%的相似性。

3.根據權利要求1或2所述的taq?dna聚合酶抗體或其抗原結合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結合片段為單克隆抗體、fab、fab'、f(ab')2、fv、單鏈抗體或多特異抗體。

4.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼權利要求1~3任一項所述的taq?dna聚合酶抗體...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李鳳嬌，趙海龍，馬玉嶺，陳新新，苑曉松，路軻，王芳，魏彥輝，
申請(專利權)人：北京索萊寶科技有限公司，
類型：發明
國別省市：