【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物。更具體地，涉及膜蛋白ralb在鑒別與區分豬x精子方面的應用，具體是利用豬精子膜蛋白ralb在x精子細胞的表面差異性地表達，區分或鑒別豬x和y精子的應用。
技術介紹
1、動物的性別控制(sex?control)技術是通過對動物的正常生殖過程進行人為干預，使成年雌性動物產出人們期望性別后代的一門生物技術。性別控制技術在畜牧生產中意義重大。首先，通過控制后代的性別比例，可充分發揮受性別限制的生產性狀(如泌乳)和受性別影響的生產性狀(如生長速度、肉質等)的最大經濟效益。其次，控制后代的性別比例可增加選種強度，加快育種進程。通過控制胚胎性別還可克服牛胚胎移植中出現的異性孿生不育現象，排除伴性有害基因的危害。性別控制可以通過精子分離或胚胎性別鑒別來實現。
2、目前現有的性別控制技術包括在精子發生過程中通過基因編輯技術改變產生x精子和y精子的比例、根據x精子和y精子的大小、活力、電荷、表面抗原和dna含量等方面的差異分離成熟精子、通過改變雌性生殖道環境來篩選最終到達卵母細胞的精子以及通過早期胚胎鑒定來篩選體外胚胎的性別。但是由于成本昂貴、現有技術受限等問題，大部分的技術仍然停留在實驗室階段，無法在畜牧業生產實踐中使用。流式細胞儀分選精子技術是目前最為成功的精子分選技術，已經廣泛運用于奶牛的生產實踐中。然而在養豬業中，很少使用流式細胞儀分選精子，因為在流式細胞儀分選的過程中豬精子的細胞膜被破壞，導致其活力、受精能力、體外保存的能力下降。此外，母豬單次輸精的量比較大，通常比牛需要的高得多。因此，目前急需一種新的方法
3、膜蛋白，通常是指細胞膜上的蛋白，約占細胞膜成分的30％，是生物膜功能的主要承擔者。如果可以鑒定x、y精子膜上的差異性蛋白，那么就可以針對其通過抗原抗體反應(蛋白免疫法)或膜蛋白受體信號刺激分選x、y精子。相較于流式細胞分選，該方法簡單易行，能夠滿足生豬產業單次輸精量的需求且分選過程中對精子細胞的有害影響較少。已有研究通過maldi-tof-ms(chen?x,j?proteomics.2012,77:59-67)、nuplc-ms/ms(de?caniom,molecular?biosystems.2014,10(6))等蛋白組學技術對牛x、y精子差異性蛋白進行了鑒定。然而，在豬中目前未有成功驗證的性別差異性精子膜蛋白報告。
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題是探索一種豬x精子上的差異性蛋白，從而利用該蛋白在x精子細胞的表面差異性地表達，更簡單易行地鑒別豬x精子和豬y精子。
2、本專利技術的目的是提供一種豬精子膜蛋白ralb在鑒別或區分豬x精子和豬y精子中的應用。
3、本專利技術另一目的是提供一種鑒別豬x精子和豬y精子的方法。
4、本專利技術上述目的通過以下技術方案實現：
5、本專利技術提供了豬精子膜蛋白ralb在鑒別或區分豬x精子和豬y精子中的應用，所述鑒別或區分的方法為利用ralb蛋白在x精子細胞的表面差異性地表達的特性進行鑒別或區分，該蛋白在x精子的表達高于y精子。
6、優選地，膜蛋白ralb在x精子的表達量比在y精子的表達量高50％以上。
7、更優選地，膜蛋白ralb在x精子的表達量比在y精子的表達量高53％以上。
8、具體地，所述豬精子膜蛋白ralb的氨基酸序列在uniprot數據庫中對應的蛋白id：i3lv17。
9、具體地，編碼所述的ralb蛋白的基因的核苷酸序列在ncbi數據庫上對應的基因id：100624229。
10、本專利技術還提供了一種鑒別豬x精子和豬y精子的方法，所述鑒別方法為利用ralb蛋白在x精子細胞的表面差異性地表達的特性進行鑒別或區分，該蛋白在x精子的表達顯著高于y精子。
11、優選地，所述鑒定方法為以ralb蛋白為分子標記，檢測ralb蛋白的表達量，通過ralb蛋白表達量的差異進行判斷。
12、更具體地，膜蛋白ralb在x精子的表達量比在y精子的表達量高50％以上。
13、更具體地，膜蛋白ralb在x精子的表達量比在y精子的表達量高53％以上。
14、更優選地，檢測ralb蛋白的表達量的鑒定方法為蛋白質印跡法或免疫熒光法。
15、更具體地，所述蛋白質印跡法檢測ralb蛋白表達量的步驟如下：
16、s1、對經過xy精子分離后的兩種精液樣品分別提取膜蛋白，測定精子的蛋白濃度；
17、s2、使精子蛋白變性，采用10％質量比的sds-page凝膠電泳分離膜蛋白；
18、s3、將步驟s2獲得的膠片轉移至硝酸纖維素膜上；用緩沖液將膜洗滌，隨后用含5％質量比的脫脂奶粉的tbst緩沖液在室溫條件下封閉1h～2h；
19、s4、用緩沖液將膜洗滌，加入ralb抗體和gapdh抗體，4℃過夜；然后再次用緩沖液洗滌，然后用二抗在室溫條件下孵育1h～2h；
20、s5、用緩沖液洗滌，隨后使用低背景化學發光檢測試劑盒進行了印跡曝光，然后統計印跡的灰度值。
21、更優選地，s2中蛋白變性方法為：取含有30μg精子蛋白作為上樣量，加入17％體積比的6×protein?loading?buffer和mem-pertmplus增溶緩沖液補至20μl，99℃孵育10min。
22、更優選地，緩沖液為tbst溶液，再加入溶液0.1％體積的tween20。
23、更優選地，s4使用的二抗為辣根過氧化物酶標記山羊抗兔igg(h+l)
24、更優選地，s5使用的發光試劑盒為cecl?western?blot?kit。
25、更優選地，s5使用的統計軟件為image?j。
26、作為一些可選擇的實施方案，ralb蛋白在豬育種中的應用：
27、1、鑒定豬x和y精子的方法，包含如下步驟：以ralb蛋白為分子標記，采用蛋白質印跡法或免疫熒光鑒定豬x和y精子，其中，ralb蛋白在x精子細胞的表面差異性地表達。
28、2、分離豬x和y精子的方法，包含如下步驟：以ralb蛋白為抗原或受體，采用抗體抗原反應或配體反應差異性改變豬x或y精子的功能，從而分離x或y精子，其中，ralb蛋白在x精子細胞的表面差異性的表達。
29、本專利技術具有以下有益效果：
30、本專利技術利用dia蛋白組學技術發現了在x精子膜蛋白中差異性表達的豬精子膜蛋白ralb，其可以作為分離豬x、y精子的差異性標識蛋白。該蛋白既可以作為分子標記，也可以作為蛋白免疫法的抗原或作為配體作用的受體改變精子功能從而分離x、y精子，有望實現一種低成本、高效、簡便的精子性別分選方法，有助于畜牧業的可持續發展，有助于緩解未來糧食緊缺問題也有助于解決一系列動物福利問題，具有重要的應用價值。
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1.豬精子膜蛋白RALB在鑒別或區分豬X精子和豬Y精子中的應用，其特征在于，所述鑒別或區分的方法為利用RALB蛋白在X精子細胞的表面差異性地表達的特性進行鑒別或區分，該蛋白在X精子的表達高于Y精子。
2.根據權利要求1所述應用，特征在于，膜蛋白RALB在X精子的表達量比在Y精子的表達量高50％以上。
3.根據權利要求1所述應用，特征在于，所述豬精子膜蛋白RALB的氨基酸序列在Uniprot數據庫對應的蛋白ID：I3LV17。
4.根據權利要求1所述應用，特征在于，編碼所述的RALB蛋白的基因的核苷酸序列在NCBI數據庫上對應的基因ID：100624229。
5.一種鑒別豬X精子和豬Y精子的方法，其特征在于，利用RALB蛋白在X精子細胞的表面差異性地表達的特性進行鑒別或區分，該蛋白在X精子的表達顯著高于Y精子。
6.根據權利要求5所述方法，特征在于，所述鑒定方法為以RALB蛋白為分子標記，檢測RALB蛋白的表達量，通過RALB蛋白表達量的差異進行判斷。
7.根據權利要求6所述方法，特征在于，檢測RALB蛋白的表
8.根據權利要求6所述方法，特征在于，檢測RALB蛋白的表達量的方法為免疫熒光法。
9.根據權利要求6所述方法，特征在于，膜蛋白RALB在X精子的表達量比在Y精子的表達量高50％以上。
10.根據權利要求9所述方法，特征在于，膜蛋白RALB在X精子的表達量比在Y精子的表達量高53％以上。
...【技術特征摘要】
1.豬精子膜蛋白ralb在鑒別或區分豬x精子和豬y精子中的應用，其特征在于，所述鑒別或區分的方法為利用ralb蛋白在x精子細胞的表面差異性地表達的特性進行鑒別或區分，該蛋白在x精子的表達高于y精子。
2.根據權利要求1所述應用，特征在于，膜蛋白ralb在x精子的表達量比在y精子的表達量高50％以上。
3.根據權利要求1所述應用，特征在于，所述豬精子膜蛋白ralb的氨基酸序列在uniprot數據庫對應的蛋白id：i3lv17。
4.根據權利要求1所述應用，特征在于，編碼所述的ralb蛋白的基因的核苷酸序列在ncbi數據庫上對應的基因id：100624229。
5.一種鑒別豬x精子和豬y精子的方法，其特征在于，利用ralb...
【專利技術屬性】
技術研發人員：洪林君，吳珍芳，吳昌華，謝言射，張獻偉，蔡更元，李紫聰，顧婷，楊化強，鄭恩琴，徐錚，黃思秀，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：
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