【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本公開涉及在檢測樣品中的靶rna序列中應用的產品和方法。
技術介紹
1、2020年3月11日，covid-19被宣布為全球大流行，114個不同的國家報告了超過118,000例病例。三個月內，188個國家的病例數已增至近650萬例。為了減少其在人群中的傳播，準確有效的病毒檢測策略是必要的。該策略的關鍵部分是以減少試驗時間并提高樣品通量為目的，進行持續的試驗開發。鑒于sars-cov-2感染的臨床癥狀可能類似于普通感冒和流感，因此明確識別病毒本身對于有效診斷至關重要。在疾病的早期階段，這只能通過檢測病毒rna來真正實現。
2、診斷行業迅速響應，開發了一系列檢測平臺，cdc、賽默飛世爾(thermo?fisher)和英國公共衛生局(public?health?england)等都發布了測試來應對這場前所未有的危機。1用于sars-cov-2檢測的最常見試驗方法是基于qpcr的檢測方法，每個樣品需要多于60分鐘的時間，并且通常涉及兩步過程。首先，使用逆轉錄酶將病毒rna轉化為互補dna(cdna)，這一過程可能需要多達30分鐘。2然后進行定量聚合酶鏈式反應(qpcr)以擴增cdna，并使用熒光染料檢測所述cdna，該過程需要多達一個小時。3–5為了縮短試驗時間，過去幾個月的文獻中出現了大量sars-cov-2rna檢測的新方法。可以說，其中最成功的方法是將等溫方法應用于dna擴增，大大加快了擴增速度并因此減少了試驗時間。6,7最常見的等溫擴增系統是環介導等溫擴增(lamp)。已經針對sars-cov-2開發了lamp方法，但
3、另一種常用于診斷試驗的技術是指數擴增反應(expar)。expar反應僅限于dna，因為反應所需的切口核酸內切酶僅對dna雙鏈體有活性。這意味著若要使用expar檢測rna，需要rna->dna步驟。這通常由逆轉錄酶(rt)反應提供。除了經常需要rt步驟外，expar比其他類似技術更快，因為它經過優化，只需要非常短的單鏈序列即可擴增。expar試驗所需的時間通常無法進一步優化，因為得到的短片段不具有期望溫度下的結合能量以形成引發聚合酶所需的雙鏈體。可以通過升高溫度來提高速率，但這也意味著需要更長的序列以產生雙鏈體。這意味著提高expar速度的方法(例如采用rt步驟的基于expar的試驗)是受限的。此外，進行試驗所需的任何附加反應都將進一步增加總試驗時間。
技術實現思路
1、本公開的基礎是鑒定和利用能夠使rna/dna雙鏈體的dna鏈產生切口的酶，并且利用帶切口的dna以產生擴增產物。在一方面教導中，擴增產物可以使用指數擴增反應(expar)產生。根據本文的教導，專利技術人顯示他們可以在10分鐘內(例如在5分鐘內)準確地識別樣品(例如，covid-19患者樣品)rna。
2、在第一方面教導中，提供了一種用于檢測樣品中的靶rna序列的方法，所述方法包括：
3、a)在第一溫度，使樣品與結合物dna分子和限制性核酸內切酶接觸，所述限制性核酸內切酶能夠在特異性識別序列處使rna/dna復合物的dna鏈產生切口，以產生帶切口的dna分子，
4、其中所述結合物dna分子能夠在第一溫度與靶rna序列特異性結合，從而形成rna/dna雙鏈體：結合物dna分子包含：在第一溫度不與靶rna序列結合且包含與模板dna分子互補的序列的部分序列；和，能夠在第一溫度特異性結合至靶rna序列且包括特異性識別序列的另一部分序列，
5、其中所述限制性核酸內切酶在識別序列處使結合的結合物dna分子產生切口，使得帶切口的dna分子能夠從rna/dna雙鏈體釋放；或
6、a')在第一溫度，使樣品與引物，逆轉錄酶和限制性核酸內切酶接觸，所述限制性核酸內切酶能夠在特異性識別序列處使rna/dna復合物的dna鏈產生切口，以產生帶切口的dna分子，
7、其中所述引物能夠在第一溫度特異性結合至靶rna序列，從而形成rna/dna雙鏈體并在dntp和逆轉錄酶存在下起始鏈延伸并產生延伸的rna/dna雙鏈體，所述延伸的rna/dna雙鏈體包含特異性識別序列，
8、其中所述限制性核酸內切酶在識別序列處使延伸的rna/dna雙鏈體產生切口，使得帶切口的dna分子能夠從rna/dna雙鏈體釋放；和
9、b)在第二溫度，使帶切口的dna分子與模板dna分子接觸，使得帶切口的dna分子的至少3'部分結合模板dna分子并在dntp和dna聚合酶存在下起始鏈延伸并產生擴增產物；
10、以及檢測任何所述擴增產物，其中若檢測到所述擴增產物則指示樣品包含待檢測的靶rna序列。
11、如本文將更詳細地描述的，步驟a)和b)在單一腔(receptacle)/容器(container)或兩個分開的腔/容器中進行。
12、在一些教導中，第一和第二溫度是相同的溫度。
13、靶rna序列可以是任何合適的rna序列，包括人rna序列，并且可以包括mrna、rrna、sirna、hnrna、pirna、arna、mirna、來自感染原的rna和合成的rna分子等。在一教導中，靶rna序列來自感染原，并且可以采用本文描述的方法來確定樣品是否含有感染原或來自感染原的rna。因此，在一些教導中，例如，所述方法可以用于檢測對象是否被感染原感染，或者某一基質是否被感染原污染。
14、此外，對于一些整合型病毒(能整合至宿主基因組的病毒)，例如人乳頭瘤病毒(hpv)，檢測轉錄的mrna可能比檢測病毒dna更好。這是因為，就hpv而言，高危hpv的e6/e7致癌基因的表達對于發育異常表型的發展和維持是必需的。因此，e6/e7?mrna的檢測可提供比簡單檢測hpv?dna更好的預后評估。因此，根據本公開，可檢測在細胞中轉錄的hpv和其它整合型病毒的mrna。實例包括愛潑斯坦-巴爾病毒(ebv)；肝炎，例如乙型肝炎病毒(hbv)和丙型肝炎病毒(hcv)；腺相關病毒-2(aav-2)；和逆轉錄病毒，例如hiv和內源性逆轉錄病毒(erv1)
15、感染原可以是例如細菌、真菌或病毒。在某些教導中，感染原是單鏈或雙鏈rna病毒、或基因組整合型病毒，其中其一個或多個基因由宿主細胞轉錄。這樣的教導尤其適合于單鏈rna病毒的檢測，例如包括正鏈和負鏈rna病毒。
16、正鏈rna病毒分為黃色病毒門(kitrinoviricota)、光滑裸露病毒門(lenarviricota)和小核糖病毒門(pisuviricota)(具體分類為小南嵌套病毒綱(pisoniviricetes)和(stelpavirictes))，所有這些病毒都屬于正核糖病毒界(orthornavirae)和核糖病毒域(riboviria)。它們是單系的，源自共同的rna病毒祖先。
17、正義rna病毒占已知病毒的很大一部分，包括許多病原體，例如丙型肝炎病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒以及sars、本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種檢測樣品中靶RNA序列的方法，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟a)/a')和b)在單一反應管、腔或容器中進行。
3.根據權利要求1和2中任一項所述的方法，其中所述第一溫度和第二溫度相同。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中靶RNA序列是mRNA；rRNA；siRNA；hnRNA；piRNA；aRNA；miRNA；來自感染原的RNA；或合成的RNA分子。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述感染原是細菌、真菌或病毒。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述病毒是單鏈或雙鏈RNA病毒，或能整合至宿主細胞基因組中并轉錄產生mRNA的病毒。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述病毒是正義RNA病毒，例如丙型肝炎病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、SARS、MERS和SARS-CoV-2冠狀病毒。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述SARS-CoV-2冠狀病毒是CoVID-19。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟a)的結合物DNA分子與
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述DNA限制性核酸內切酶是BstNI、AvrII或PhoI。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中擴增產物通過可變熱循環(例如PCR)或等溫擴增技術和/或線性或指數擴增反應(EXPAR)產生。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述EXPAR包括鏈置換擴增(SDA)或切口酶擴增反應(NEAR)。
13.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中通過發光、UV或可見光譜或度譜術、熒光光譜或度譜術、質譜、液相色譜、熒光偏振、電化學、電泳、酶標記、熒光標記、化學發光、生物發光、表面等離振子共振(SPR)、熒光團修飾的探針DNA、裸眼視檢、通過合適的發色/顏色變化或產生(例如通過使用合適的標簽或染料修飾的探針或核酸)或其任意組合來檢測擴增產物。
14.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在所述方法開始后15分鐘內、小于10分鐘、小于9、8、7、6或甚至5分鐘檢測擴增產物。
15.一種在根據前述權利要求中任一項所述的方法中應用的結合物DNA分子，所述結合物DNA分子能夠特異性結合RNA模板，所述結合物DNA分子包含：
16.根據權利要求15所述的結合物DNA，其中所述結合物DNA的長度為20–50個核苷酸。
17.根據權利要求15或16中任一項所述的結合物DNA，其中不結合靶RNA序列的區域的長度為2-8個核苷酸和/或位于結合物DNA的5’末端。
18.根據權利要求15-17中任一項所述的結合物DNA，其包含一個或多個化學修飾，任選地其中所述一個或多個化學修飾位于所述結合物DNA的3’和/或5’末端。
19.根據權利要求15-18中任一項所述的結合物DNA分子，其中所述結合物DNA分子基本由以下序列組成，或由以下序列組成：
20.根據權利要求19所述的結合物DNA分子，其中所述結合物DNA分子基本由以下序列組成，或由以下序列組成：
21.根據權利要求1-14中任一項所述的方法中應用的試劑盒，所述試劑盒基本由以下組成或由以下組成：
22.根據權利要求21所述的試劑盒，其中所述結合物DNA分子是根據權利要求15-20中任一項所述的結合物DNA分子。
23.根據權利要求21或22中任一項所述的試劑盒，其中所述限制性核酸內切酶是BstNI、AvrII或PhoI。
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種檢測樣品中靶rna序列的方法，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟a)/a')和b)在單一反應管、腔或容器中進行。
3.根據權利要求1和2中任一項所述的方法，其中所述第一溫度和第二溫度相同。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中靶rna序列是mrna；rrna；sirna；hnrna；pirna；arna；mirna；來自感染原的rna；或合成的rna分子。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述感染原是細菌、真菌或病毒。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述病毒是單鏈或雙鏈rna病毒，或能整合至宿主細胞基因組中并轉錄產生mrna的病毒。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述病毒是正義rna病毒，例如丙型肝炎病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、sars、mers和sars-cov-2冠狀病毒。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述sars-cov-2冠狀病毒是covid-19。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟a)的結合物dna分子與靶rna分子的解鏈溫度在45–70℃的范圍內，并且帶切口的dna分子的解鏈溫度在30–45℃的范圍內。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述dna限制性核酸內切酶是bstni、avrii或phoi。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中擴增產物通過可變熱循環(例如pcr)或等溫擴增技術和/或線性或指數擴增反應(expar)產生。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述expar包括鏈置換擴增(sda)或切口酶擴增反應(near)。
13.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中通過發光、uv或可見光譜或度譜術、熒光光譜或度譜術、...
【專利技術屬性】
技術研發人員：J·塔克，T·達福恩，J·卡特，JL·H·A·杜普雷，L·O·伊圖爾布，M·希克斯，
申請(專利權)人：伯明翰大學，
類型：發明
國別省市：
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