【技術實現步驟摘要】
大體來說，本專利技術涉及用于基因組修飾的組合物和方法。
技術介紹
1、基因組編輯技術具有治療多種疾病和病癥的潛力，所述疾病和病癥包括但不限于癌癥，遺傳病癥和hiv/aids。體細胞的基因組編輯是治療開發的有前途的領域，復雜的酶編輯工具crispr-cas9已被用于從人胚胎的種系中消除人β-球蛋白(hbb)基因(otieno，(2015)，j?clin?res?bioeth?6：253.doi:10.4172/2155-9627.1000253)。但是，從歷史上看，基因編輯技術的臨床應用受到多種因素的限制，其中包括編輯事件的頻率低、脫靶事件高或其組合。
2、因此，本專利技術的目的是提供用于基因遞送和基因編輯的改進的組合物和方法。
技術實現思路
0、專利技術簡述
1、提供了工程化轉座子及其使用方法。轉座子通常包括rna成分和蛋白質成分。rna成分可以包括例如dna靶向序列、一個或多個蛋白質結合基序以及待整合在dna靶位點上的目標核酸序列。通常將dna靶向序列、蛋白質結合基序和目標序列可操作地連接，以使它們可以與衍生自限制樣內切核酸酶長散在(rle?line)元件蛋白質的蛋白質成分結合并被逆轉錄，從而獲得的cdna可以在dna靶位點整合到dna中，例如在細胞基因組中的dna。目標序列可以編碼例如基因或其片段或功能性核酸。
2、參與結合蛋白質、蛋白質結合基序(pmb)的rna區段通常與蛋白質成分的rna結合結構域(結構域-1)、逆轉錄酶、接頭結構域、內切
3、rna成分可以包括來自或衍生自親本line或sine骨架的元件，并且rna成分的目標核酸序列通常與line或sine異源。在典型的實施方案中，dna靶向序列與親本line或sine是異源的。rna成分可以包括例如來自或衍生自親本line或sine元件的3'pbm序列，crispr/cas示蹤序列、crispr/cas引導序列或其組合，來自或衍生自親本line或sine元件的5'pbm序列，優選其中任何ires序列都是無功能的，核酶如丁型肝炎病毒樣核酶，或其任何組合。
4、蛋白質成分通常衍生自rle?line元件蛋白質，并且可以包括一個或多個dna結合結構域、一個或多個rna結合結構域、逆轉錄酶，接頭結構域和內切核酸酶。通常，將dna結合結構域、rna結合結構域、逆轉錄酶、接頭結構域和內切核酸酶可操作地連接，使得它們可以在dna靶位點結合rna成分和dna(例如細胞基因組dna)，促進rna成分逆轉錄為cdna，并將cdna在dna靶位點整合到dna中。通常，dna結合結構域相對于親本line?dna結合結構域是突變的，或者親本dna結合結構域被備選的dna結合結構域取代。在一些實施方案中，dna結合結構域是來自另一種dna結合蛋白的dna結合結構域或其基序，例如螺旋-轉角-螺旋、鋅指、亮氨酸拉鏈、翼狀螺旋、翼狀螺旋-轉角-螺旋、螺旋-環-螺旋，hmg-盒、wor3結構域、ob折疊結構域、免疫球蛋白折疊、b3結構域、tal效應子或rna導向結構域。通常，rna結合結構域、逆轉錄酶、接頭結構域和內切核酸酶中的一個或多個的序列與line元件蛋白質的序列相同，或優選相對于親本line元件蛋白質進行突變以改善與rna成分或靶dna的結合和/或酶活性。
5、在一些實施方案中，rna成分的親本line或sine骨架和蛋白質成分的親本line骨架是相同的line和/或sine源自line的祖先或是line的祖先。rna成分的rna序列、蛋白質序列的氨基酸序列或其組合可以是親本骨架的重組序列和/或變體。
6、還提供了編碼rna成分和蛋白質成分的載體，以及包括所述成分、載體和/或由此形成的工程化轉座子的藥物組合物。優選地，轉座子可以在dna靶位點的整合反應期間形成生產性的4向連接。
7、還提供了使用方法。例如，將目標核酸序列引入一個或多個細胞的基因組中的方法，所述方法可以包括使一個或多個細胞與(i)rna成分或編碼rna成分的載體和蛋白質成分或編碼蛋白質成分的載體的組合；或(ii)包含rna成分和蛋白質成分的工程化轉座子接觸?？梢栽隗w外或體內接觸細胞。在一些實施方案中，離體修飾的細胞隨后被引入需要其的受試者中。在一些實施方案中，將組合物直接施用至需要其的受試者。
8、還提供了治療疾病和病癥的方法。在這樣的用途中，目標核酸序列在細胞中的表達可以改善疾病或病癥的一種或多種癥狀，或改善疾病或病癥潛在的分子途徑。在優選的實施方案中，修飾有效數量的細胞以治療患有疾病或病癥的受試者。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.RNA成分，其包含DNA靶向序列，一個或多個蛋白質結合基序(PBM)以及待整合到DNA靶位點中的目標核酸序列，其中所述DNA靶向序列，蛋白質結合基序和目標序列可操作地連接，使得它們能夠與源自親本長散在(LINE)元件蛋白質的蛋白質成分結合并逆轉錄成cDNA，所述cDNA能夠在DNA靶位點整合到DNA中。
2.根據權利要求1所述的RNA成分，其中所述蛋白質成分包含RNA結合結構域、接頭結構域、逆轉錄酶、DNA內切核酸酶中的一個或多個，其中所述一個或多個蛋白質結合基序將所述RNA成分結合至所述蛋白質成分的所述RNA結合結構域、接頭結構域、逆轉錄酶、DNA內切核酸酶或其組合。
3.根據權利要求1或2所述的RNA成分，
4.根據權利要求1-3中任一項所述的RNA成分，其中所述DNA靶向序列與所述親本LINE或SINE是異源的。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的RNA成分，其中所述目標序列編碼基因、基因的片段或功能性核酸。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的RNA成分，其包含來自或衍生自親本LINE或SINE元件的3′P
7.根據權利要求1-6中任一項所述的RNA成分，其包含CRISPR/Cas示蹤序列、CRISPR/Cas引導序列或其組合。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的RNA成分，其包含來自或衍生自親本LINE或SINE元件的5′PBM序列。
9.根據權利要求8所述的RNA成分，其中所述5′PBM包含非功能性IRES序列。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的RNA成分，其進一步包含核酶。
11.根據權利要求10所述的RNA成分，其中所述核酶是丁型肝炎病毒樣核酶。
12.根據權利要求2-10中任一項所述的RNA成分，其中所述親本LINE或SINE是限制樣內切核酸酶(RLE)LINE。
13.根據權利要求10所述的RNA成分，其中RLE?LINE是R2?LINE。
14.根據權利要求3-13中任一項所述的RNA成分，其中所述RNA成分的親本LINE或SINE骨架與所述蛋白成分的親本LINE骨架是相同的LINE和/或所述SINE源自LINE的祖先或是LINE的祖先。
15.蛋白質成分，其包含DNA結合結構域、RNA結合結構域、逆轉錄酶、接頭結構域和內切核酸酶，其中所述DNA結合結構域、RNA結合結構域、逆轉錄酶、接頭結構域和內切核酸酶可操作地連接，使得它們可以在DNA靶位點與RNA成分和DNA結合，并促進RNA成分逆轉錄成cDNA，和cDNA在DNA靶位點整合到DNA中。
16.根據權利要求15所述的蛋白質成分，其中所述RNA成分包含DNA靶向序列，一個或多個蛋白質結合基序以及待整合到所述DNA靶位點的目標核酸序列。
17.根據權利要求15或16所述的蛋白質成分，其中所述RNA成分包含來自或衍生自親本LINE或SINE骨架的元件，并且所述RNA成分的目標核酸序列與所述LINE或SINE異源；
18.根據權利要求15-17中任一項所述的蛋白質成分，其中所述DNA結合結構域相對于親本LINE?DNA結合結構域是突變的。
19.根據權利要求15-17中任一項所述的蛋白質成分，其中所述DNA結合結構域由相對于親本LINE?DNA結合結構域的備選DNA結合結構域取代。
20.根據根據權利要求19所述的蛋白質成分，其中所述DNA結合結構域是來自另一DNA結合蛋白質的DNA結合結構域。
21.根據權利要求19或20所述的蛋白質成分，其中所述DNA結合結構域包含以下一種或多種：螺旋-轉角-螺旋，鋅指，亮氨酸拉鏈，翼狀螺旋，翼狀螺旋-轉角-螺旋，螺旋-環-螺旋，HMG-盒，Wor3結構域，OB折疊結構域，免疫球蛋白折疊，B3結構域，TAL效應子或RNA導向結構域。
22.根據權利要求15至22中任一項所述的蛋白質成分，其中所述RNA結合結構域、逆轉錄酶、接頭結構域和內切核酸酶中的一個或多個的序列與所述親本LINE元件蛋白質的序列相同，或被突變以改善RNA成分相對于親本LINE元件蛋白質的結合或酶促活性。
23.根據權利要求17-22中任一項所述的蛋白質成分，其中所述親本LINE或SINE是限制樣內切核酸酶(RLE)LINE。
24.根據權利要求23所述的蛋白質成分，其中所述RLE?LINE是R2LINE。
25.根據權利要求17至24中任一項所述的蛋白成分，其中所述RNA成分的親本LINE或SINE骨架和所述蛋白質成分的親本LINE骨架是...
【技術特征摘要】
1.rna成分，其包含dna靶向序列，一個或多個蛋白質結合基序(pbm)以及待整合到dna靶位點中的目標核酸序列，其中所述dna靶向序列，蛋白質結合基序和目標序列可操作地連接，使得它們能夠與源自親本長散在(line)元件蛋白質的蛋白質成分結合并逆轉錄成cdna，所述cdna能夠在dna靶位點整合到dna中。
2.根據權利要求1所述的rna成分，其中所述蛋白質成分包含rna結合結構域、接頭結構域、逆轉錄酶、dna內切核酸酶中的一個或多個，其中所述一個或多個蛋白質結合基序將所述rna成分結合至所述蛋白質成分的所述rna結合結構域、接頭結構域、逆轉錄酶、dna內切核酸酶或其組合。
3.根據權利要求1或2所述的rna成分，
4.根據權利要求1-3中任一項所述的rna成分，其中所述dna靶向序列與所述親本line或sine是異源的。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的rna成分，其中所述目標序列編碼基因、基因的片段或功能性核酸。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的rna成分，其包含來自或衍生自親本line或sine元件的3′pbm序列。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的rna成分，其包含crispr/cas示蹤序列、crispr/cas引導序列或其組合。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的rna成分，其包含來自或衍生自親本line或sine元件的5′pbm序列。
9.根據權利要求8所述的rna成分，其中所述5′pbm包含非功能性ires序列。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的rna成分，其進一步包含核酶。
11.根據權利要求10所述的rna成分，其中所述核酶是丁型肝炎病毒樣核酶。
12.根據權利要求2-10中任一項所述的rna成分，其中所述親本line或sine是限制樣內切核酸酶(rle)line。
13.根據權利要求10所述的rna成分，其中rle?line是r2?line。
14.根據權利要求3-13中任一項所述的rna成分，其中所述rna成分的親本line或sine骨架與所述蛋白成分的親本line骨架是相同的line和/或所述sine源自line的祖先或是line的祖先。
15.蛋白質成分，其包含dna結合結構域、rna結合結構域、逆轉錄酶、接頭結構域和內切核酸酶，其中所述dna結合結構域、rna結合結構域、逆轉錄酶、接頭結構域和內切核酸酶可操作地連接，使得它們可以在dna靶位點與rna成分和dna結合，并促進rna成分逆轉錄成cdna，和cdna在dna靶位點整合到dna中。
16.根據權利要求15所述的蛋白質成分，其中所述rna成分包含dna靶向序列，一個或多個蛋白質結合基序以及待整合到所述dna靶位點的目標核酸序列。
17.根據權利要求15或16所述的蛋白質成分，其中所述rna成分包含來自或衍生自親本line或sine骨架的元件，并且所述rna成分的目標核酸序列與所述line或sine異源；
18.根據權利要求15-17中任一項所述的蛋白質成分，其中所述dna結合結構域相對于親本line...
【專利技術屬性】
技術研發人員：肖恩·克里斯滕森，
申請(專利權)人：德克薩斯州大學系統董事會，
類型：發明
國別省市：
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