【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因沉默，具體涉及甘薯生長素響應因子arf基因沉默載體質粒及方法的構建與應用，更具體的是涉及arf基因沉默載體質粒的構建及其通過病毒誘導的基因沉默(virus?induced?gene?silencing，vigs)的方法在甘薯基因功能研究或遺傳育種中的應用。
技術介紹
1、植物生長素響應因子arf(auxinresponse?factor)參與調節植物的眾多生理反應,在植物生長發育過程中起到重要調控作用。甘薯是旋花科一年生草本植物，是重要的糧食作物和工業原料作物，其全基因組已經公布，在甘薯基因組網站上能夠找到預測的甘薯的arf基因，但其基因功能尚未見報道。
2、病毒誘導的基因沉默(virus?induced?gene?silencing，vigs)是一種不依賴于轉基因技術的基因功能缺失研究方法，可以簡便、高效的沉默靶標基因。以煙草脆裂病毒(tobacco?rattle?virus，trv)為介導的vigs體系具有侵染效率高、沉默時間長、引起的癥狀輕等諸多優勢，是目前vigs技術中應用最廣泛的病毒載體質粒。trv病毒具有兩條rna鏈，分別是包含rna1組分(ptrv1)和rna2組分(ptrv2),trv誘導的基因沉默需要ptrv1和ptrv2兩個載體質粒的共同作用。
3、基于trv的植物vigs體系已經在很多植物上獲得了成功，但在甘薯基因功能的研究上，有關vigs應用的報道并不多；并且不同的vigs病毒載體質粒接種方法也會影響基因的沉默效率；因此，亟待建立一種trv介導的甘薯基因沉默方法，
技術實現思路
1、本專利技術公開了甘薯生長素響應因子arf基因沉默及方法的構建與應用，能夠實現甘薯arf基因的高效沉默，進而為甘薯基因功能研究及遺傳育種奠定基礎。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、甘薯arf基因可用于調節甘薯不定根生長，arf基因部分片段的核苷酸序列如seqid?no：1所示。
4、甘薯arf基因沉默載體質粒trv::arf，包括ptrv1和ptrv2-arf；
5、ptrv2-arf為ptrv2中插入seq?id?no：1所示arf基因的部分片段構建獲得。
6、進一步地，ptrv2-arf的構建方法如下：
7、(1)根據seq?id?no：1所示甘薯的arf基因片段設計引入ecor?i酶切位點和bamhi酶切位點的特異性引物，擴增arf基因部分片段；
8、(2)將步驟(1)獲得的arf基因部分片段連接到t載體質粒上，轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆，提取質粒進行測序驗證；
9、(3)采用ecor?i和bamhi對ptrv2質粒與步驟(2)獲得的陽性克隆質粒分別進行雙酶切，將雙酶切產物連接后轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆，提取質粒，得到ptrv2-arf。
10、進一步地，引物包括：
11、上游引物
12、mq-arf-411-f：5’-cggaattctgggaattccaagcaggcaa-3’，seq?id?no：2，其中gaattc為ecor?i酶切位點；
13、下游引物
14、mq-arf-411-r：5’-cgggatccctgcagcaagcagtccaatg-3’，seq?id?no：3，其中ggatcc為bamhi酶切位點。
15、甘薯arf基因沉默方法，包括如下步驟：
16、(1)選擇“r”型甘薯莖段作為材料；“r”型甘薯莖段為帶有兩個節和一個腋芽的甘薯莖段；
17、(2)將權利要求2載體質粒ptrv1和ptrv2-arf分別轉化農桿菌；
18、(3)分別將轉入了載體質粒ptrv1和ptrv2-arf的農桿菌按1:1的體積比制成農桿菌混合液，依次加入乙酰丁香酮、半胱氨酸和tween?20后制成農桿菌侵染液，對“r”型甘薯莖段進行減壓處理，結束后再共培養以促進侵染；
19、(4)將步驟(3)侵染后的“r”型甘薯莖段清洗后再進行培養。
20、選擇“r”型甘薯莖段作為材料時盡量保證莖段的生長狀態相同、大小和粗細一致，能縮小不同莖段之間沉默效率的差異；且帶有兩個節有利于生根和成活，避免因莖段本身原因影響對基因功能的判斷。
21、進一步地，步驟(1)選擇“r”型甘薯莖段時，優選橫切面直徑約1-1.5cm，莖段形態學上端的切口為平切口，形態學下端的切口為楔形切口且呈30°夾角。
22、進一步地，步驟(3)轉入載體質粒ptrv1和ptrv2-arf的農桿菌的od600均為1-1.2；
23、乙酰丁香酮、半胱氨酸、tween?20與轉入載體質粒ptrv1和ptrv2-arf的農桿菌混合液的配比關系為：9.81mg：200mg：2.5ml：500ml。
24、進一步地，步驟(3)中的減壓處理具體為：將“r”型甘薯莖段浸入農桿菌侵染液，在0.03mpa～0.05mpa壓強下減壓處理3min～5min。
25、減壓處理時應注意減壓處理的時長和壓強，時間過長或壓強過高都會導致莖段受到減壓處理傷害嚴重甚至死亡，時間過短或壓強過低都會導致農桿菌不足以進入莖段實現侵染，從而影響沉默效率。
26、進一步地，步驟(3)中的共培養具體為：將減壓處理后的莖段繼續浸泡在農桿菌侵染液中，使用封口膜封口，28℃、180rpm條件下恒溫振蕩培養30min～40min；共培養條件也會影響侵染。
27、進一步地，侵染時使用的農桿菌侵染液濃度od600值為1.0-1.2，濃度過高會使抽濾減壓處理后的莖段感染病毒癥狀掩蓋沉默表現型，嚴重甚至會引起死亡，濃度過低則達不到侵染的目的。
28、進一步地，步驟(4)中，將侵染后的“r”型甘薯莖段取出，無菌水沖洗2-3次，使用濃度為0.002mg/l的naa工作液遮光培養48h后，置于25℃、60％濕度、16h光照/8h黑暗的光周期下培養。侵染后的培養條件會影響基因沉默效率。
29、上述甘薯arf基因沉默載體質粒或甘薯arf基因沉默方法可用于甘薯基因功能研究或遺傳育種。
30、綜上所述，本專利技術通過構建甘薯arf基因沉默載體載體質粒以及基因沉默方法，可實現甘薯arf基因的高效沉默，arf基因被沉默后生根數減少，根長變短，證明本vigs體系在甘薯上取得了成功，甘薯vigs體系構建的成功將對甘薯基因功能的深入研究以及甘薯遺傳育種研究具有重要價值。
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1.甘薯ARF基因在調節甘薯不定根生長中的應用，其特征在于，所述ARF基因部分片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
2.甘薯ARF基因沉默載體質粒，其特征在于，
3.根據權利要求2所述的甘薯ARF基因沉默載體質粒，其特征在于，所述pTRV2-ARF的構建方法如下：
4.根據權利要求3所述的甘薯ARF基因沉默載體質粒，其特征在于，所述引物包括：
5.甘薯ARF基因沉默方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.根據權利要求5所述的甘薯ARF基因沉默方法，其特征在于，步驟(3)中的所述轉入載體質粒pTRV1和pTRV2-ARF的農桿菌的OD600均為1-1.2；
7.根據權利要求5所述的甘薯ARF基因沉默方法，其特征在于，步驟(3)中的所述的減壓處理具體為：將“r”型甘薯莖段浸入農桿菌侵染液，在0.03MPa～0.05MPa壓強下減壓處理3min～5min。
8.根據權利要求5所述的甘薯ARF基因沉默方法，其特征在于，步驟(3)中的所述的共培養具體為：將減壓處理后的莖段繼續浸泡在農桿菌侵染液中，使
9.根據權利要求5所述的甘薯ARF基因沉默方法，其特征在于，步驟(4)中，將侵染后的“r”型甘薯莖段取出，無菌水沖洗2-3次，使用濃度為0.002mg/L的NAA工作液遮光培養48h后，置于25℃、60％濕度、16h光照/8h黑暗的光周期下培養。
10.權利要求2-4任一項所述甘薯ARF基因沉默載體質粒或權利要求5-9所述甘薯ARF基因沉默方法在甘薯基因功能研究或遺傳育種中的應用。
...【技術特征摘要】
1.甘薯arf基因在調節甘薯不定根生長中的應用，其特征在于，所述arf基因部分片段的核苷酸序列如seq?id?no：1所示。
2.甘薯arf基因沉默載體質粒，其特征在于，
3.根據權利要求2所述的甘薯arf基因沉默載體質粒，其特征在于，所述ptrv2-arf的構建方法如下：
4.根據權利要求3所述的甘薯arf基因沉默載體質粒，其特征在于，所述引物包括：
5.甘薯arf基因沉默方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.根據權利要求5所述的甘薯arf基因沉默方法，其特征在于，步驟(3)中的所述轉入載體質粒ptrv1和ptrv2-arf的農桿菌的od600均為1-1.2；
7.根據權利要求5所述的甘薯arf基因沉默方法，其特征在于，步驟(3)中的所述的減壓處理具體為：將...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉起麗，李成偉，姜良良，郎劍鋒，杜建峰，胡海燕，黃勝勝，王海榮，曾孫孟，雷閃閃，
申請(專利權)人：河南科技學院，
類型：發明
國別省市：
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