【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及醫學，特別涉及一種間質細胞自噬模型的建立方法。
技術介紹
1、gerd是指胃內容物反流至食管而引起反酸、燒心一系列癥狀和/或不適的疾病。該病全球患病率約為13.98％，并呈上升趨勢，且容易反復，可增加食管癌、間質性肺炎等多種疾病的發病風險，嚴重危害患者的身心健康。因此，該病仍是目前行業重點關注的公共衛生問題之一。大量證據表明，胃食管動力障礙是gerd發病主要原因之一。作為特殊的消化道起搏器細胞，cajal間質細胞(interstitial?cells?of?cajal，iccs)啟動有節奏的生物電慢波觸發消化道收縮與蠕動，以維持消化道正常運動功能。iccs功能缺失是引起消化道動力障礙而致病的主要原因。自噬是一種依賴于溶酶體自行降解細胞內成分的分解代謝過程。生理情況下，細胞自噬可將損傷的細胞器和細胞進行清理，維持機體的穩態。當自噬過度時，可破壞細胞結構，導致細胞功能缺失。課題組前期動物實驗已證實，胃食管iccs自噬是引發gerd的關鍵病理機制。食管iccs自噬模型是研究gerd病理分子機制和藥物作用機理的一種重要手段。現有技術中缺乏iccs自噬模型相關的建立方法。有鑒于此，特提出一種間質細胞自噬模型的建立方法。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種間質細胞自噬模型的建立方法，其能夠實現間質細胞自噬模型的建立。
2、本專利技術的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：
3、一種間質細胞自噬模型的建立方法，包括如下步驟：
4、原
5、免疫熒光鑒定；
6、分組與干預：取生長對數期iccs，經胰酶消化離心后計數，并接種2×105個細胞至25c㎡的細胞培養瓶中，貼壁24h后，更換培養基；將iccs分為0μm組、25μm組、50μm組、75μm組、100μm組，分別給予0μm、25μm、50μm、75μm、100μm濃度的脫氧膽酸誘導3h；
7、活性檢測；
8、蛋白相對表達水平檢測；
9、轉錄水平檢測；
10、超微結構觀察；
11、lc3及beclin-1表達量檢測。
12、在一個優選實施例中，原代分離與培養具體包括：在無菌條件下取出食管，置于含雙抗的pbs液中，剝除外膜，去除黏膜及黏膜下層，得肌層，將肌層剪成1-2mm3小塊，自然沉降棄上清，加入0.1％ⅱ型膠原酶消化液，37℃水浴鍋消化30min，吸出的上清酶液置于完全培養基中4℃保存，加入新的消化液，37℃水浴箱消化30min，將第二次消化后的組織懸液與前面的消化液混勻，過100目細胞篩，收集濾液300g，5min得細胞沉淀，pbs洗一遍后加入完全培養基重懸后鋪板，置37℃、5％co2培養箱培養，此后每2～3d換液一次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。
13、在一個優選實施例中，免疫熒光鑒定具體包括：在培養板中將已爬好細胞的培養皿用pbs浸洗3次，每次3min；用4％的多聚甲醛固定15min，pbs浸洗培養皿3次，每次3min；pbs浸洗培養皿3次，每次5min，用移液槍吸干培養皿內的pbs，在培養皿內滴加5％bsa，37℃封閉30min；用移液槍吸干培養皿內的封閉液，不洗，每個培養皿滴加足夠量一抗cd117，4℃冰箱過夜，滴加熒光二抗cy3，37℃孵育30min，pbs充分淋洗，用移液槍吸干培養皿內的pbs，在培養皿內滴加5％bsa，37℃封閉30min，滴加dapi避光孵育3min，對標本進行染核，用pbs沖洗，置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
14、在一個優選實施例中，活性檢測具體包括：各組iccs分別加入0μm、25μm、50μm、75μm、100μm濃度的脫氧膽酸誘導3h后，將待測的96孔板細胞換成相同的培養基，每孔100ul，每孔加入10ulcck8試劑，置于培養箱中孵育2h，酶標儀在450nm波長處檢測每孔的吸光值。
15、在一個優選實施例中，蛋白相對表達水平檢測具體包括：iccs經不同濃度脫氧膽酸誘導3h后，pbs洗滌3次，每次5min，棄掉培養皿中細胞培養液，每孔加入200μl的細胞裂解液，用細胞刮將細胞刮至一側，移液槍吸入已做好標記的ep管中；細胞破碎儀使細胞完全破碎；12000r/min高速離心機離心10min，取上清液，bca法測量蛋白濃度，蛋白經10％sds-page分離膠和5％sds-page濃縮膠分離后轉移至pvdf膜，用300ma恒流轉膜；3％的脫脂牛奶封閉液封閉pvdf膜1h，將pvdf膜孵育一抗β-actin、lc3-ii/i一抗過夜；過夜孵育后的pvdf膜使用tbst洗滌3次，每次5min；將pvdf膜孵育二抗2小時，tbst洗滌3次后，配置發光液，用發光液浸濕pvdf膜后放置于超高靈敏度化學發光成像系統樣品放置區運行程序顯影成像
16、在一個優選實施例中，轉錄水平檢測具體包括：采用trizon試劑提取組織/細胞中的總rna，采用rna超純提取試劑盒提取mrna，利用紫外可見分光光度計測定mrna的濃度和純度，通過rna逆轉錄試劑盒合成cdna，采用熒光pcr儀進行熒光定量pcr。
17、在一個優選實施例中，超微結構觀察具體包括：iccs經不同濃度脫氧膽酸誘導3h后，pbs洗滌3次，每次3min；使用胰蛋白酶消化細胞并收集離心去上清，最后加入3％戊二醛、1％鋨酸雙重固定，丙酮逐級脫水及二甲酸二丙烯酯包埋，超薄切片處理，使用透射電鏡進行觀察和攝圖。
18、在一個優選實施例中，lc3及beclin-1表達量檢測具體包括：iccs用pbs浸洗3次后用4％的多聚甲醛固定15min，pbs浸洗培養皿3次，每次3min；0.5％triton?x-100室溫通透20min；pbs浸洗培養皿3次，每次5min，吸移液槍吸干培養皿中的pbs，在培養皿中滴加5％bsa，37℃封閉30min；用移液槍吸干培養皿內的封閉液，不洗，每個培養皿滴加足夠量的稀釋好的一抗:beclin-1，lc3，4℃冰箱過夜；取出培養皿，室溫復溫45min，pbs浸洗培養皿3次，每次5min，滴加稀釋好的熒光二抗cy3，37℃孵育30min，pbs充分淋洗；滴加dapi避光孵育3min，對標本進行染核，用pbs沖洗多余的dapi，用50％甘油封閉培養皿；置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
19、在一個優選實施例中，所述培養皿中包含本體、磁性膜片和鼓動膜片，所述磁性膜片包括基體和多個磁片，所述多個磁片貼在所述基體上，且均勻分布，所述鼓動膜片的邊緣設有黏貼邊，所述基體和所述鼓動膜片采用橡膠材料制成，所述磁性膜片鋪設于所述本體的底部，所述鼓動膜片覆蓋于所述磁性膜片上，所述黏貼邊貼合所述本體的內側壁。
20、在一個優選實施例中，所述培養皿還包括安置座，所述安置座包括座體和磁塊，所述座體上設有安置槽，所述安置槽的側壁上設有安置臺階，所述磁塊設于所述安置槽中，所述本體置于所述安置臺階上。
21、iccs為間質細胞。
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【技術保護點】
1.一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，原代分離與培養具體包括：在無菌條件下取出食管，置于含雙抗的PBS液中，剝除外膜，去除黏膜及黏膜下層，得肌層，將肌層剪成1-2mm3小塊，自然沉降棄上清，加入0.1％Ⅱ型膠原酶消化液，37℃水浴鍋消化30min，吸出的上清酶液置于完全培養基中4℃保存，加入新的消化液，37℃水浴箱消化30min，將第二次消化后的組織懸液與前面的消化液混勻，過100目細胞篩，收集濾液300g，5min得細胞沉淀，PBS洗一遍后加入完全培養基重懸后鋪板，置37℃、5％CO2培養箱培養，此后每2～3d換液一次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。
3.根據權利要求1所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，免疫熒光鑒定具體包括：在培養板中將已爬好細胞的培養皿用PBS浸洗3次，每次3min；用4％的多聚甲醛固定15min，PBS浸洗培養皿3次，每次3min；PBS浸洗培養皿3次，每次5min，用移液槍吸干培養皿內的PBS，在培養皿內滴加5％BSA，37℃封
4.根據權利要求1所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，活性檢測具體包括：各組ICCs分別加入0μM、25μM、50μM、75μM、100μM濃度的脫氧膽酸誘導3h后，將待測的96孔板細胞換成相同的培養基，每孔100ul，每孔加入10ulCCK8試劑，置于培養箱中孵育2H，酶標儀在450nm波長處檢測每孔的吸光值。
5.根據權利要求1所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，蛋白相對表達水平檢測具體包括：ICCs經不同濃度脫氧膽酸誘導3h后，PBS洗滌3次，每次5min，棄掉培養皿中細胞培養液，每孔加入200μL的細胞裂解液，用細胞刮將細胞刮至一側，移液槍吸入已做好標記的EP管中；細胞破碎儀使細胞完全破碎；12000r/min高速離心機離心10min，取上清液，BCA法測量蛋白濃度，蛋白經10％SDS-PAGE分離膠和5％SDS-PAGE濃縮膠分離后轉移至PVDF膜，用300mA恒流轉膜；3％的脫脂牛奶封閉液封閉PVDF膜1h，將PVDF膜孵育一抗β-actin、LC3-II/I一抗過夜；過夜孵育后的PVDF膜使用TBST洗滌3次，每次5min；將PVDF膜孵育二抗2小時，TBST洗滌3次后，配置發光液，用發光液浸濕PVDF膜后放置于超高靈敏度化學發光成像系統樣品放置區運行程序顯影成像。
6.根據權利要求1所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，轉錄水平檢測具體包括：采用Trizon試劑提取組織/細胞中的總RNA，采用RNA超純提取試劑盒提取mRNA，利用紫外可見分光光度計測定mRNA的濃度和純度，通過RNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，采用熒光PCR儀進行熒光定量PCR。
7.根據權利要求1所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，超微結構觀察具體包括：ICCs經不同濃度脫氧膽酸誘導3h后，PBS洗滌3次，每次3min；使用胰蛋白酶消化細胞并收集離心去上清，最后加入3％戊二醛、1％鋨酸雙重固定，丙酮逐級脫水及二甲酸二丙烯酯包埋，超薄切片處理，使用透射電鏡進行觀察和攝圖。
8.根據權利要求1所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，LC3及Beclin-1表達量檢測具體包括：ICCs用PBS浸洗3次后用4％的多聚甲醛固定15min，PBS浸洗培養皿3次，每次3min；0.5％Triton?X-100室溫通透20min；PBS浸洗培養皿3次，每次5min，吸移液槍吸干培養皿中的PBS，在培養皿中滴加5％BSA，37℃封閉30min；用移液槍吸干培養皿內的封閉液，不洗，每個培養皿滴加足夠量的稀釋好的一抗:Beclin-1，lc3，4℃冰箱過夜；取出培養皿，室溫復溫45min，PBS浸洗培養皿3次，每次5min，滴加稀釋好的熒光二抗Cy3，37℃孵育30min，PBS充分淋洗；滴加DAPI避光孵育3min，對標本進行染核，用PBS沖洗多余的DAPI，用50％甘油封閉培養皿；置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
9.根據權利要求3或8所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，所述培養皿中包含本體、磁性膜片和鼓動膜片，所述磁性膜...
【技術特征摘要】
1.一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，原代分離與培養具體包括：在無菌條件下取出食管，置于含雙抗的pbs液中，剝除外膜，去除黏膜及黏膜下層，得肌層，將肌層剪成1-2mm3小塊，自然沉降棄上清，加入0.1％ⅱ型膠原酶消化液，37℃水浴鍋消化30min，吸出的上清酶液置于完全培養基中4℃保存，加入新的消化液，37℃水浴箱消化30min，將第二次消化后的組織懸液與前面的消化液混勻，過100目細胞篩，收集濾液300g，5min得細胞沉淀，pbs洗一遍后加入完全培養基重懸后鋪板，置37℃、5％co2培養箱培養，此后每2～3d換液一次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。
3.根據權利要求1所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，免疫熒光鑒定具體包括：在培養板中將已爬好細胞的培養皿用pbs浸洗3次，每次3min；用4％的多聚甲醛固定15min，pbs浸洗培養皿3次，每次3min；pbs浸洗培養皿3次，每次5min，用移液槍吸干培養皿內的pbs，在培養皿內滴加5％bsa，37℃封閉30min；用移液槍吸干培養皿內的封閉液，不洗，每個培養皿滴加足夠量一抗cd117，4℃冰箱過夜，滴加熒光二抗cy3，37℃孵育30min，pbs充分淋洗，用移液槍吸干培養皿內的pbs，在培養皿內滴加5％bsa，37℃封閉30min，滴加dapi避光孵育3min，對標本進行染核，用pbs沖洗，置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
4.根據權利要求1所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，活性檢測具體包括：各組iccs分別加入0μm、25μm、50μm、75μm、100μm濃度的脫氧膽酸誘導3h后，將待測的96孔板細胞換成相同的培養基，每孔100ul，每孔加入10ulcck8試劑，置于培養箱中孵育2h，酶標儀在450nm波長處檢測每孔的吸光值。
5.根據權利要求1所述一種間質細胞自噬模型的建立方法，其特征在于，蛋白相對表達水平檢測具體包括：iccs經不同濃度脫氧膽酸誘導3h后，pbs洗滌3次，每次5min，棄掉培養皿中細胞培養液，每孔加入200μl的細胞裂解液，用細胞刮將細胞刮至一側，移液槍吸入已做好標記的ep管中；細胞破碎儀使細胞完全破碎；12000r/min高速離心機離心10min，取上清液，bca法測量蛋白濃度，蛋白經10％sds-page分離膠和5％sds-page濃縮膠分離后轉移至pvdf膜，用300ma恒流轉膜；3％的脫脂牛奶封閉液封閉pvdf膜1h，將pvdf膜孵育一抗β-act...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黎麗群，謝勝，劉禮劍，譚金晶，黃曉燕，羅貞藝，
申請(專利權)人：廣西中醫藥大學第一附屬醫院廣西中醫醫院，
類型：發明
國別省市：
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