甲胎蛋白磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種AFP磁微粒 化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒包括： 1)AFP校準(zhǔn)品；2)抗異硫氰酸酯熒光素(FITC)單克隆抗體包被的磁微粒溶液； 3)生物素標(biāo)記的AFP單克隆抗體與FITC標(biāo)記的AFP單克隆抗體的混合液； 4)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素；5)化學(xué)發(fā)光底物液；以及6)反應(yīng)管。 進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明專利技術(shù)制備上述試劑盒的方法包括以下步驟：1)以AFP純品配 制校準(zhǔn)品；2)制備FITC抗體包被的磁微粒溶液；3)制備生物素標(biāo)記的AFP 單克隆抗體與FITC標(biāo)記的AFP單克隆抗體的混合液；4)用辣根過氧化物酶 標(biāo)記鏈親和素；5)配制化學(xué)發(fā)光底物液；6)分裝上述校準(zhǔn)品、磁顆粒溶液、 混合液、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液和反應(yīng)管；以及7)組裝為成品。本發(fā) 明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本專利技術(shù)提供了一種寬范圍、高靈敏 測定甲胎蛋白(a-fetoprotein, AFP)的磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備 方法。本專利技術(shù)試劑盒結(jié)合了生物素一親和素免疫放大技術(shù)、免疫磁微粒分離技術(shù) 和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)。
技術(shù)介紹
癌癥自從誕生之日起就對人類的生存健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。目前腫瘤治療的 關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)、早期治療。但是目前醫(yī)院診斷早期腫瘤，主要是靠影像學(xué)和 細(xì)胞病理學(xué)診斷技術(shù)， 一般都是在具有明顯的占位性病變和臨床癥狀后才得以確 診，但這已不是癌變的最早期。隨著腫瘤早期診斷進(jìn)入蛋白質(zhì)時(shí)代，以血液為代 表的體液蛋白質(zhì)成為腫瘤標(biāo)志研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。越來越多腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對 建立發(fā)展快速、高靈敏、高特異肺瘤標(biāo)志物新型檢測技術(shù)提出了更高的要求。原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC， 又稱為Primary liver cell carcinoma),是世界范圍內(nèi)第五大常見癌癥，致命率居于第三位。在中國，肝癌 發(fā)病率是世界其它地區(qū)的三到四倍，占世界肝癌發(fā)病總數(shù)的40%多。目前報(bào)道的關(guān) 于HCC的腫瘤標(biāo)志物有多種，其中以曱胎蛋白(AFP)最受關(guān)注。AFP是由一個(gè)天冬 酰胺連接到糖鏈上的一種糖蛋白，分子量大約為70000 Dalton，在胚胎發(fā)育階段 由嬰兒的卵黃囊和肝臟大量分泌，嬰兒出生后12~18個(gè)月內(nèi)迅速減少，血清含量 低于10 |u g/L。血清學(xué)檢測AFP作為HCC參照物已經(jīng)被世界多家權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可，包 括歐洲肝臟研究協(xié)會(EASL)、英國胃腸病學(xué)研究協(xié)會(Br Soc GE )、歐洲肺瘤 標(biāo)志物組織(EGTM)和美國國立綜合癌癥網(wǎng)(NCCN)。并且AFP做為HCC診斷參考標(biāo)準(zhǔn)也受到美國NACB (National Academy of Clinical Biochemistry)的支持， 該機(jī)構(gòu)強(qiáng)調(diào)曱胎蛋白檢測并連續(xù)觀察AFP在體內(nèi)的變化情況對于早期診斷HCC具 有重要的臨床價(jià)值。由于AFP在非腫瘤人群(如肝炎)或孕婦體內(nèi)均有可能大幅升 高，所以寬范圍的檢測是必需的。例如AFP在100-300 jug/L之間者必須進(jìn)行隨訪， 密切觀察AFP的動態(tài)變化，注意可能的小肝癌；AFP在350-500 pg/L,或含量明 顯增高者，必須參考其他;險(xiǎn)查，高度警惕原發(fā)性肝癌的可能；AFP為500~1000 p g/L，且含量在短期內(nèi)不斷升高，原發(fā)性肝癌可能性很大，但必須建議做活檢；AFP 大于IOOO jag/L者，甚至在近期內(nèi)AFP含量迅速升高，則原發(fā)性肝癌診斷基本可 確定。所以高靈敏的檢測是疾病早期預(yù)警的要求，而寬范圍又是動態(tài)監(jiān)測所必需 的。免疫學(xué)測定是以抗體-抗原的特異性識別、抗體標(biāo)記技術(shù)和示蹤技術(shù)為基礎(chǔ)的 定量技術(shù)，在腫瘤標(biāo)志物的體液檢測中具有廣泛應(yīng)用。目前檢測AFP的免疫學(xué)方 法主要有石英晶體微天平法、元素示蹤ICP-MS法、空間分辨熒光法、乳液光度免 疫分析法、電化學(xué)免疫分析、毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光檢測。這些方法均具有不可避 免的不足之處如石英晶體微天平、ICP-MS價(jià)格昂貴，空間分辨熒光法易受到環(huán) 境的干擾，光度分析法檢測靈敏度較低、毛細(xì)管電泳的重現(xiàn)性較差，而電化學(xué)免 疫分析又需要特殊的裝置。同時(shí)這些方法的工作范圍大多在0-600)jg/L之間，對 高濃度樣品必須進(jìn)行稀釋方可測定，根本無法滿足含量大于600 pg/L后的連續(xù)監(jiān) 測。化學(xué)發(fā)光免疫分析法結(jié)合了免疫反應(yīng)的高特異性和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏性， 儀器簡單，成本低廉，可達(dá)到10-'8摩爾檢測水平，且檢測范圍可達(dá)6個(gè)數(shù)量級， 因而得到了越來越多的關(guān)注。在實(shí)際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質(zhì)成分較多， 一定程度上影 響了檢測靈敏度和準(zhǔn)確性，所以從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中快速分離、純化出目的待測 物，是臨床檢驗(yàn)工作者面臨的難題之一。免疫磁微粒技術(shù)是利用高分子材料合成6一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有 特異性親合力的各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，使其致敏為免疫磁微粒，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好；操作簡單；不影響被分離細(xì)胞或其它生物材 料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外加磁場作用下定向運(yùn)動，使得某些特殊成分 得以分離、濃集或純化。免疫磁微粒技術(shù)與化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)結(jié)合檢測待測物，可大大提高檢測 的靈敏度和準(zhǔn)確性，它以微米級磁微粒為載體，利用表面有機(jī)物提供的羧基活性 基團(tuán)與蛋白質(zhì)氨基共價(jià)結(jié)合，采用抗體進(jìn)行搭橋成免疫磁微粒，可進(jìn)行抗原、 抗體反應(yīng)。該技術(shù)的新穎之處有(l)采用微小的磁微粒作為固相可增加包被表面 積，從而增加了抗體的有效包被量，不僅節(jié)省了抗體，而且有助于建立寬范圍的 免疫檢測方法，尤其適合于高濃度臨床樣本的測定，避免彎鉤效應(yīng)的發(fā)生；(2)利 用順磁鐵微粒為固相載體，外包被單克隆抗體，增加抗原、抗體的接觸面積及底 物發(fā)光面積，提高反應(yīng)的靈敏度，并采用旋轉(zhuǎn)磁場使磁微粒起攪拌作用及分離結(jié) 合抗原-抗體與游離抗體的作用；(3)在液相反應(yīng)中，使用發(fā)光增強(qiáng)劑，將水分子 從發(fā)光底物的發(fā)光位點(diǎn)排開，同時(shí)還可縮短發(fā)光的達(dá)峰時(shí)間；(4)使用單克隆抗體， 提高了反應(yīng)的特異性。生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system, BAS )具有多級的信號放大作 用，并且不增加非特異性干擾，且具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高、適用性 強(qiáng)和實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn)。生物素-親和素免疫放大技術(shù)可以直接用標(biāo)記親和素連接 生物素化大分子反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，這種方法稱為標(biāo)記親和素-生物素法。待測反 應(yīng)體系可以利用生物素化抗體，使得親和素-生物素系統(tǒng)與免疫分析檢測體系偶 聯(lián)，放大終反應(yīng)先將針對不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化抗體與抗原(標(biāo) 準(zhǔn)抗原和待測抗原)同時(shí)反應(yīng)，在固相載體表面形成雙抗體夾心免疫復(fù)合物，再7加入親和素與復(fù)合物中的生物素結(jié)合，最終使反應(yīng)信號放大，從而提高了免疫分 析的靈敏度。化學(xué)發(fā)光免疫分析結(jié)合生物素-親和素系統(tǒng)和免疫磁微粒固相分離體系是一 種檢測AFP的先進(jìn)而有效的方法，有助于促進(jìn)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在臨床檢驗(yàn)、 檢測中的應(yīng)用與發(fā)展。曾經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道利用生物素-親和素系統(tǒng)的信號放大原理實(shí) 現(xiàn)對AFP的熒光免疫檢測，但與化學(xué)發(fā)光檢測及磁微粒系統(tǒng)結(jié)合建立高靈敏、寬 范圍的方法則未見報(bào)道。并且現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒為封閉式全 自動化學(xué)發(fā)光測量系統(tǒng)，需要昂貴的全自動化學(xué)發(fā)光測量儀，從而限制了推廣使 用，無法廣泛地應(yīng)用于臨床診斷和科研工作。本專利技術(shù)是在酶免疫分析的基礎(chǔ)上應(yīng) 用酶催化發(fā)光底物，通過;f企測發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號代替酶免疫分析中的顯色底 物，因而其靈敏度大大提高，并且操作簡便適用性廣，既可應(yīng)用于開放式的半自 動化學(xué)發(fā)光測量儀，也可用于全自動的測量系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)大批量、快檢測，使用 成本低，更易推廣應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)同時(shí)解決了上述問題，即將生物素-親和素免疫放大技術(shù)和免疫磁微粒 技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，檢測AFP，提供了一種高靈敏、寬范圍、簡便快 速、穩(wěn)定地定量檢測AFP的測定試劑盒，該試劑盒適于產(chǎn)業(yè)化，具有良好的市場 應(yīng)用前景。本專利技術(shù)的目的是提供一種生物素一親和素免疫放大技術(shù)和免疫磁微粒技術(shù)結(jié) 合化學(xué)發(fā)光免疫分本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種甲胎蛋白磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：　１）ＡＦＰ校準(zhǔn)品；　２）抗異硫氰酸熒光素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）單克隆抗體包被的磁微粒溶液；　３）生物素 標(biāo)記的ＡＦＰ單克隆抗體與ＦＩＴＣ標(biāo)記的ＡＦＰ單克隆抗體的混合液；　４）辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素；　５）上述辣根過氧化物酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；以及　６）反應(yīng)管。

【技術(shù)特征摘要】
1、一種甲胎蛋白磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)AFP校準(zhǔn)品；2)抗異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)單克隆抗體包被的磁微粒溶液；3)生物素標(biāo)記的AFP單克隆抗體與FITC標(biāo)記的AFP單克隆抗體的混合液；4)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素；5)上述辣根過氧化物酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；以及6)反應(yīng)管。2、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述生物素標(biāo)記的AFP單克隆 抗體與FITC標(biāo)記的AFP單克隆抗體的混合比例為1: 2。3、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物液包含A 液和B液，其中，A液是0. 1M pH值為8. 5的Tris-HCl緩沖液，包含4. Omg/mL的魯米諾或異 魯米諾和0. 3mg/mL的對硤苯酚；B液是0. 1M pH值為4. 6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液。4、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒使用的反應(yīng)管 材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。5、 一種制備權(quán)利要求l所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟 1)以AFP純品配制^f交準(zhǔn)品；2) 制備抗FITC單克隆抗體包被的磁微粒；3) 制備生物素標(biāo)記的AFP單克隆抗體與FITC標(biāo)記的AFP單克隆抗體的混合液；4) 以辣#>過氧化物酶標(biāo)記鏈親和素；5)配制辣根過氧化物酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾；6) 分裝上述校準(zhǔn)品、磁顆粒溶液、混合液、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液 和反應(yīng)管；以及7) 組裝為成品。6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在所述制備抗F...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王栩，張倩云，林金明，李振甲，應(yīng)希堂，胡國茂，
申請(專利權(quán))人：王栩，張倩云，林金明，李振甲，應(yīng)希堂，胡國茂，
類型：發(fā)明
國別省市：11