【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及光學(xué)探針，尤其涉及一種精氨酸光學(xué)探針及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、精氨酸作為20種天然氨基酸之一，最初是由schlus于1886年從植物羽扇豆苗中分離提取，其分子結(jié)構(gòu)于20世紀(jì)初已經(jīng)清楚并能進(jìn)行人工合成。精氨酸在生物體內(nèi)以具有生理活性的l-型精氨酸形式發(fā)揮生物學(xué)功能。精氨酸不僅是機(jī)體蛋白質(zhì)的組成成分，而且是多種生物活性物質(zhì)的合成前體，如多胺和no等，通過刺激部分激素分泌，參與內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和機(jī)體特異性免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程；此外還作為尿素循環(huán)的中間體，通過尿素循環(huán)解除氨中毒，避免由于氨過量造成的代謝紊亂；在機(jī)體的勻質(zhì)代謝方面起著重要作用，可用于多種代謝途徑，包括精氨酸酶、一氧化氮合酶、精氨酸/甘氨酸胍基轉(zhuǎn)移酶、精氨酰-trna合成酶等。因此，精氨酸的多種生物學(xué)功能引起了科研工作者的廣泛重視，成為目前氨基酸研究的熱點(diǎn)之一。
2、哺乳動(dòng)物中精氨酸的代謝主要有兩個(gè)途徑，一是在精氨酸酶作用下，精氨酸分解為鳥氨酸和尿素，鳥氨酸是合成多胺類物質(zhì)的前體，多胺對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要意義；二是在一氧化氮合酶作用下，精氨酸分解為等分子的瓜氨酸和no，no是細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間及神經(jīng)遞質(zhì)作用的信使分子，廣泛參與細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞。另外，作為脒基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的脒基供體，精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸共同合成胍基乙酸和磷酸肌酸。在神經(jīng)組織，精氨酸也合成γ-胍基丁酸(delforge?j等,eur?jbiochem.1975,57(1):231-239；fernandez?ml等,j.bacteriol.2004,186(18):6
3、精氨酸是形成肌酸的三種底物之一，肌酸是一種重要的營(yíng)養(yǎng)素(缺乏會(huì)導(dǎo)致智力遲鈍)，也被用來形成腹水，也是一種體內(nèi)的信號(hào)分子。精氨酸是尿素(含l-鳥氨酸、l-瓜氨酸和精氨琥珀酸)和一氧化氮循環(huán)(含鳥氨酸和精氨琥珀酸)中的一種中間產(chǎn)物，并通過鳥氨酸產(chǎn)生可調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的多胺結(jié)構(gòu)。精氨酸的缺乏(可通過增加精氨酸酶的活性來誘導(dǎo)，這種酶可將精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸)會(huì)損害b細(xì)胞功能(免疫性)并損害毛發(fā)和肌肉生長(zhǎng)也可能損害神經(jīng)肌肉功能。已知精氨酸酶在ii型糖尿病患者中過度表達(dá)，是該人群隊(duì)列中心血管疾病發(fā)展的危險(xiǎn)因素，腎衰竭患者可能會(huì)降低精氨酸酶。
4、正是由于精氨酸具有上述重要的作用，因此精氨酸含量的檢測(cè)也尤為重要。精氨酸的常用檢測(cè)方法是毛細(xì)管電泳法(li?x-t等，chem?res?chin?univ?2013,29(3):434-438；meng?j等，the?analyst?2010,135(7):1592-1599)、高效液相色譜法(tateda?n等，analytical?sciences:the?international?journal?of?the?japan?society?foranalytical?chemistry?2001,17(6):775-778；wadud?s等，journal?of?chromatographyb,analytical?technologies?in?the?biomedical?and?life?sciences?2002,767(2):369-374)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以及紫外可見光分光光度法(hortpro?ma等，j?am?chem?so2003,125(1):20-21；pu?f等,anal?chem?2010,82(19):8211-8216；du?j等，chemicalcommunications(cambridge,england)2013,49(47):5399-5401；engeser?m等，chemicalcommunications?1999,(13):1191-1192)和熒光光譜測(cè)定法(engeser?m等，chemicalcommunications?1999,(13):1191-1192)。
5、但是在活細(xì)胞研究中這些檢測(cè)方法存在很大的缺陷，需要經(jīng)過耗時(shí)的樣品處理過程：細(xì)胞破碎、分離提取純化等，不能在活細(xì)胞和亞細(xì)胞器中進(jìn)行原位、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、高通量和高時(shí)空分辨率的檢測(cè)。本領(lǐng)域仍需要能在細(xì)胞內(nèi)、外實(shí)時(shí)原位、定量、高通量檢測(cè)精氨酸的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)的目的在于提供一種在細(xì)胞內(nèi)外實(shí)時(shí)定位、高通量、定量檢測(cè)精氨酸的精氨酸熒光探針。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供以下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)第一方面提供一種精氨酸敏感多肽，所述精氨酸敏感多肽是精氨酸結(jié)合蛋白的變體，其：
4、(1)具有seq?id?no:1所示的序列并且在選自以下的1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)或更多個(gè)位置具有突變：t32、e37、f71、g89、m90、d91、r96、e135、t138、t139、h140、d177，所述氨基酸突變包括氨基酸的修飾、取代或缺失，或
5、(2)是與(1)所述序列具有至少70％序列相同性并具有(1)所述突變并保留對(duì)精氨酸敏感性的序列。
6、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述突變選自t32a、e37a、f71a、g89a、m90a、d91a、r96a、e135a、t138a、t139a、h140a、d177a中的1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)或更多個(gè)。
7、本專利技術(shù)還提供一種精氨酸光學(xué)探針，包含精氨酸敏感多肽和光學(xué)活性多肽或其功能變體，其中光學(xué)活性多肽或其功能變體位于精氨酸敏感多肽的序列內(nèi)。精氨酸敏感多肽被光學(xué)活性多肽或其功能變體分為第一部分和第二部分。
8、本專利技術(shù)提供一種精氨酸光學(xué)探針，包括精氨酸敏感多肽b和光學(xué)活性多肽a，其中光學(xué)活性多肽a位于精氨酸敏感多肽b的序列內(nèi)，將精氨酸敏感多肽b分為第一部分b1和第二部分b2，形成b1-a-b2式的探針結(jié)構(gòu)。
9、在一個(gè)實(shí)施方案中，精氨酸敏感多肽：
10、(1)具有seq?id?no:1所示的序列并且在選自以下的1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)或更多個(gè)位置具有突變：t32、e37、f71、g89、m90、d91、r96、e135、t138、t139、h140、d177，所述氨基酸突變包括氨基酸的修飾、取代或缺失，或
11、(2)是與(1)所述序列具有至少70％序列相同性并具有(1)所述突變并保留對(duì)精氨酸敏感性的序列。
12、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述突變選自t32a、e37a、f71a、g89a、m90a、d91a、r96a、e135a、t138a、t139a、h140a、d177a中的1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)或更多個(gè)。
13、在一個(gè)實(shí)施方案中，光學(xué)活性多肽是熒光蛋白或其功能片段或變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光蛋白是源自yfp的黃色熒光蛋白。優(yōu)選地，熒光蛋白是如seq?id?no:3所示的cpyfp。
14、在一個(gè)實(shí)施方案中，光學(xué)探針還包含側(cè)接所述光學(xué)活性多肽的一個(gè)或多個(gè)接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，光學(xué)活性多肽側(cè)翼包含不超過5個(gè)氨本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種精氨酸敏感多肽，所述精氨酸敏感多肽是精氨酸結(jié)合蛋白的變體，其：
2.一種光學(xué)探針，包含權(quán)利要求1所述的精氨酸敏感多肽和光學(xué)活性多肽或其功能變體，其中光學(xué)活性多肽或其功能變體位于精氨酸敏感多肽的序列內(nèi)，
3.如權(quán)利要求2所述的光學(xué)探針，其特征在于，所述光學(xué)活性多肽是熒光蛋白或其功能片段，
4.如權(quán)利要求2或3所述的光學(xué)探針，其特征在于，光學(xué)探針為所述精氨酸敏感多肽的200/203位點(diǎn)插入有cpYFP并且具有選自T32A、E37A、F71A、G89A、M90A、D91A、R96A、E135A、T138A、T139A、H140A、D177A的一個(gè)或多個(gè)突變的探針，
5.一種核酸分子，其包含：
6.包含權(quán)利要求5所述的核酸分子的核酸構(gòu)建物，
7.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞：
8.制備權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的光學(xué)探針的方法，包括：提供權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，在所述光學(xué)探針表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和分離光學(xué)探針或融合多肽。
9.權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的光學(xué)探針、權(quán)利要求5所
10.一種檢測(cè)試劑盒，其包含：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種精氨酸敏感多肽，所述精氨酸敏感多肽是精氨酸結(jié)合蛋白的變體，其：
2.一種光學(xué)探針，包含權(quán)利要求1所述的精氨酸敏感多肽和光學(xué)活性多肽或其功能變體，其中光學(xué)活性多肽或其功能變體位于精氨酸敏感多肽的序列內(nèi)，
3.如權(quán)利要求2所述的光學(xué)探針，其特征在于，所述光學(xué)活性多肽是熒光蛋白或其功能片段，
4.如權(quán)利要求2或3所述的光學(xué)探針，其特征在于，光學(xué)探針為所述精氨酸敏感多肽的200/203位點(diǎn)插入有cpyfp并且具有選自t32a、e37a、f71a、g89a、m90a、d91a、r96a、e135a、t138a、t139a、h140a、d177a...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙玉政，楊弋，李睿，李婷，張莉娟，姜坤，李寫，陳偉才，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：華東理工大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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