【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于植物細胞微管結構可視化，具體涉及一種利用液氮預處理與免疫熒光相結合標記植物葉片表皮細胞皮層微管結構以實現可視化的方法。
技術介紹
1、微管骨架是由α及β-tubulin蛋白構成的微管在微管結合蛋白作用下排列成復雜多變的一種動態結構，且在不同分裂狀態的細胞中呈現出皮層微管、紡錘體、成膜體等多種結構形態。研究表明，植物細胞壁纖維素合成方向、細胞各向異性生長均與皮層微管的排布密切相關，同時微管骨架通過響應外界信號動態重組參與植病互作、植物逆境脅迫等生命活動過程，因此分析皮層微管結構對于研究細胞及器官形態建成、生物及非生物脅迫抗性具有重要的作用。
2、植物細胞微管結構的可視化方法包括表達熒光融合蛋白和免疫熒光標記技術。免疫熒光標記技術將免疫學方法（抗原抗體特異結合）與熒光標記技術結合起來研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法，適用于遺傳轉化存在障礙或費時費力的物種。利用該方法標記微管骨架在動物細胞中已較成熟，但植物細胞擁有致密的細胞壁結構，阻礙抗體進入細胞內。
3、目前，通過結合細胞壁酶解技術可對by2懸浮細胞、花粉管、葉片原生質體等單細胞的微管結構進行免疫熒光標記，或結合冷凍切片技術對幼嫩的芽尖、根尖等組織內部細胞的微管骨架進行染色標記。但是，對于葉片組織表皮細胞的皮層微管結構，目前還缺乏較簡單有效的化學標記方法，尤其是一些葉片組織表面還附著有致密的表皮毛。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術旨在提供一種標記植物葉片表皮細胞皮層微管結構的方法，該方法
2、本專利技術的技術方案具體為：
3、一種植物葉片表皮細胞皮層微管結構的可視化方法，包括以下步驟：
4、s1、對葉片組織進行固定處理；
5、s2、將葉片組織放入樣品管中，置于液氮中冷凍50~70?s，取出并振動樣品管以促使細胞壁產生裂縫，待恢復室溫后再次冷凍和動蕩，重復2~4次；
6、s3、待葉片組織恢復室溫后，用含有dmso（二甲基亞砜）和np-40（乙基苯基聚乙二醇）的緩沖液浸泡20~40?min；
7、s4、依次用anti-α-tubulin、與anti-α-tubulin特異結合的含熒光標記的二抗孵育葉片組織，利用熒光即可觀察微管結構。
8、針對植物葉片表皮這一特殊部位的細胞，且葉片表面附著有致密表皮毛層和/或蠟質層等復雜結構，使其難以通過酶解和/或冷凍切片技術去暴露皮層微管結構，也導致后續難以有效地進行化學標記；本專利技術在保持現有固定處理和免疫熒光標記的基礎上，創新地引入了液氮冷凍預處理操作，通過反復速凍并振動冷凍狀態下的葉片組織，在不破壞微管結構的條件下促使細胞壁產生裂縫，進一步結合dmso和np-40處理（增加細胞膜通透性），使得一抗和二抗能夠有效對皮層微管骨架進行標記。
9、優選地，在本專利技術方法中，步驟s1中的固定處理為：將葉片組織置于固定液中，真空固定2~3?h；其中，固定液為msbt?buffer?配制而成的多聚甲醛和戊二醛混合液，其中msbt?buffer包括pipes、egta（乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸）、mgso4?7h2o和triton?x-100。在本專利技術的一個具體實施例中，固定液為4%?(w/v)?多聚甲醛和0.5%?(v/v)?戊二醛混合液，且msbt?buffer的組成為50?mm?pipes?+?5?mm?egta?+?5?mm?mgso4?7h2o?+?0.5%?(v/v)?triton?x-100。
10、優選地，在本專利技術方法中，步驟s1中的固定處理在室溫（即20-30℃）條件下進行，低溫條件易導致皮層微管（cmt）結構解聚。
11、優選地，在本專利技術方法中，所用葉片組織不含有葉脈；具體的，在取樣時，可用手術刀去除葉脈組織，并切取0.5×0.5?cm2左右的葉片組織進行后續處理。
12、優選地，在本專利技術方法中，葉片組織進行冷凍處理前，用濾紙吸去葉片組織表面液體，使葉片組織處于新鮮但不濕潤的狀態；試驗表明，葉片組織表面殘留液體會導致微管結構被不均勻破壞。
13、優選地，在本專利技術方法中，步驟s3所用緩沖液為msb?buffer配制的5-15%?(v/v)dmso和2-4%?(v/v)?np-40混合液。在本專利技術的一個具體實施例中，所用緩沖液具體為msbbuffer配制的10%?(v/v)?dmso和3%?(v/v)?np-40混合液，且msb?buffer的組成為50?mmpipes?+?5?mm?egta?+?5?mm?mgso4?7h2o。
14、優選地，在本專利技術方法中，步驟s4包括以下步驟：
15、s41、采用nabh4消除葉片組織的非特異性熒光；
16、s42、用bsa進行封閉；
17、s43、加入anti-α-tubulin抗體孵育，漂洗；
18、s44、加入與anti-α-tubulin特異結合的含熒光標記的二抗孵育，漂洗；
19、s45、加入抗熒光猝滅劑，使用共聚焦顯微鏡進行微管結構觀察。
20、更為優選地，在上述方法中，步驟s41為：將葉片組織置于msb?buffer配制的nabh4溶液中處理5-20?min。nabh4buffer預處理可以消除固定液殘存醛類產生的自發光，更有利于后續觀察。在本專利技術的一個具體實施例中，nabh4溶液的濃度為1?mg/ml，且msb?buffer的組成為50?mm?pipes?+?5?mm?egta?+?5?mm?mgso4?7h2o。
21、更為優選地，在上述方法中，步驟s42所述封閉為：將葉片組織置于pbs?buffer配制的2%?w/v?bsa封閉液中處理30-90?min。
22、更為優選地，在上述方法中，步驟s43和s44中的漂洗均采用pbs?buffer漂洗葉片組織。
23、與現有技術相比，本專利技術的有益效果為：
24、針對植物葉片組織表皮細胞的皮層微管結構，本專利技術創新地引入了液氮預處理過程，利用液氮預處理結合免疫熒光技術處理植物（如番茄）葉片組織，共聚焦顯微鏡下可直接觀察到表皮細胞完整的微管骨架，能快速定性分析出葉片表皮細胞微管結構排布方式。本專利技術利用液氮預處理促使細胞壁產生裂縫，避免了細胞壁酶解的繁瑣過程；且成功率高，能有效避免酶解造成微管解聚，以及葉片附著致密表皮毛或蠟質層等復雜結構導致抗體不能滲入等不利因素。本專利技術方法具有簡單、快速、高效的優點，為微管骨架與葉片細胞形態建立、生物及非生物脅迫抗性等研究提供一種的觀察方法。
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1.一種植物葉片表皮細胞皮層微管結構的可視化方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.?根據權利要求1所述的可視化方法，其特征在于，步驟S1所述固定處理為：將葉片組織置于固定液中，真空固定2~3?h；其中，固定液為MSBT?buffer?配制而成的多聚甲醛和戊二醛混合液，且所述MSBT?buffer包括PIPES、EGTA、MgSO4?7H2O和Triton?X-100。
3.根據權利要求2所述的可視化方法，其特征在于，步驟S1所述固定處理在室溫條件下進行。
4.根據權利要求1所述的可視化方法，其特征在于，所述葉片組織不含有葉脈。
5.根據權利要求1所述的可視化方法，其特征在于，所述植物為番茄。
6.根據權利要求1所述的可視化方法，其特征在于，所述葉片組織進行冷凍處理前，用濾紙吸去葉片組織表面液體，使葉片組織處于新鮮但不濕潤的狀態。
7.?根據權利要求1所述的可視化方法，其特征在于，步驟S3所述緩沖液為MSB?buffer配制的5-15%?(v/v)?DMSO和2-4%?(v/v)?NP-40混合液。
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