【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于腫瘤生物制品領域，涉及過繼免疫治療中的一種分泌pd-1單域抗體靶向cd105的car-t細胞(cd105-pd-1/nb?car-t)及其制備方法和應用。
技術介紹
1、t細胞可以通過表達嵌合抗原受體(chimeric?antigen?receptor,car)靶向腫瘤細胞。通過將特異性識別腫瘤抗原的單鏈抗體與可活化t細胞的受體胞內結構域“免疫受體酪氨酸活化基序”用人工方法融合成重組基因，生成重組質粒，再在體外通過轉染技術轉染到患者的t細胞，使患者t細胞表達腫瘤抗原受體，這樣的療法稱為car-t細胞療法。car-t細胞療法是當下腫瘤免疫治療的最熱門最有研究價值的治療方法。目前car-t治療在血液腫瘤中取得了很好的進展，但是由于實體腫瘤微環境復雜，car-t對實體瘤的殺傷效果有限，因此需要探索新的方法來提高car-t治療實體腫瘤的活性。
2、car的基礎設計中包括腫瘤相關抗原結合區、胞內信號區、跨膜區、胞外鉸鏈區等。car-t目前已經發展到第四代，目前在血液腫瘤中取得了較好的進展，而對于實體瘤治療，car-t細胞療效一直不佳，其中重要原因是腫瘤特異性t細胞難以突破腫瘤微環境的免疫抑制作用。除此之外目前大多數car識別抗原的部分是由單鏈抗體組成的，由于不同的單鏈抗體的vl和vh之間會出現錯配，使得表達出來單鏈抗體親和力下降，也是造成car-t治療效果不佳的原因。因此需要探索新的方法來提高car-t治療實體腫瘤的活性，進一步研究構建既能特異性識別腫瘤抗原并且產生高效抗癌作用的cd105-pd-1/nb?car
3、納米抗體(單域抗體，nb或vhh)是目前最小的功能性抗原特異性結合天然片段，由大約120個氨基酸組成，長度4nm，直徑2.5nm，相對于傳統的單克隆抗體以及fab片段(55×103)或者scfv(28×103)，納米抗體的分子量更小，因此具有更強更快的組織透過能力，能夠到達實體瘤等致密組織發揮作用。除此之外納米抗體具有穩定性好、親和力較高、免疫原性弱、易于進行基因改造、不會出現傳統抗體容易產生錯誤配對以及需要優化重鏈和輕鏈連接序列問題等優點，在腫瘤免疫治療等方面展現了廣闊的應用前景。
4、腫瘤微環境中內皮細胞增殖相關抗原已成為實體腫瘤免疫治療新靶點。endoglin(cd105)在處于增殖狀態的腫瘤血管組織內皮細胞上強表達，而在正常血管內皮細胞不表達或弱表達，是惡性腫瘤新生血管的標志。納米抗體由于分子小滲透性強等特點能夠提高實體瘤穿透性，更好地侵入實體瘤內部發揮作用。因此，構建以cd105單域抗體為基礎的car-t療法對改善實體腫瘤表現出良好的效果。
5、程序性死亡受體1(pd-1)作為免疫抑制的關鍵，一直是腫瘤免疫微環境研究的重點，旨在消除其對t細胞的負性作用，增強抗腫瘤效果。本研究構建分泌pd-1單域抗體靶向cd105的新型car-t細胞(文中命名cd105-pd-1/nb?car-t)，克服cd105?nb?car-t免疫微環境中pd-1信號的抑制作用，展示了基于單域抗體的car-t細胞靶向腫瘤微環境提高car-t細胞對實體腫瘤細胞的殺傷活性。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種工程化分泌pd-1單域抗體靶向cd105的car-t細胞。另一個目的是提供所述car-t細胞的制備方法以及提供所述car-t細胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的應用。
2、為實現上述目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、一種工程化分泌pd-1單域抗體靶向cd105的car-t細胞，所述car-t細胞是嵌合抗原受體cd105?nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb修飾的t細胞。
4、所述的分泌pd-1單域抗體靶向cd105的car-t細胞，其中所述嵌合抗原受體cd105nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb的核苷酸序列如序列表中seq?id?no.1所示。
5、一種所述car-t細胞的制備方法，該方法包括以下步驟：設計car目的序列，通過pcr法獲得cd105/nb-histag-cd8-cd137(4-1bb)-cd3ζ-2a-pd-1nb-ires的car目的序列片段。將酶切后的慢病毒載體gv401與pcr法得到的car目的序列重組。將重組后的慢病毒載體轉化至dh5α大腸桿菌中,并且篩選陽性克隆菌。進行陽性克隆菌測序驗證是否成功構建含有cd105-pd-1/nb?car-t序列的慢病毒載體。對測序成功的重組陽性克隆菌株提取質粒，轉染293t細胞后通過rt-pcr鑒定cd105-pd-1/nb?car-t序列細胞中表達情況。驗證重組慢病毒載體能正常表達后使用三質粒系統包裝慢病毒，滴度檢測，利用慢病毒感染技術構建car-t細胞，使t細胞表達該嵌合抗原受體。
6、一種如上述的car-t細胞的制備方法，所述方法包括以下步驟:
7、(1)含有car目的序列重組慢病毒載體構建：pcr法獲得cd105/nb-histag-cd8-cd137(4-1bb)-cd3ζ-2a-pd-1nb-ires的car目的序列片段，并將合成的片段亞克隆至bamhi/ecori雙酶切后的慢病毒載體gv401中，將重組后的慢病毒載體轉化至dh5α大腸桿菌中，采用慢病毒載體上的引物和目的基因上的引物對氨芐抗生素篩選后的菌落進行pcr鑒定。將鑒定成功的菌液拿去測序。測序成功使用plasmid?mini?kit進行質粒抽提。
8、(2)慢病毒包裝：采用三質粒系統，將含有car目的序列的質粒通過兩種輔助質粒helper?1.0和helper?2.0共轉染293t細胞，48h后在熒光顯微鏡下觀察細胞增強綠色熒光蛋白(egfp)的表達。成功表達熒光則收集293t細胞上清，經過濃縮純化，采用熒光稀釋法測定病毒濃度，計數egfp陽性細胞個數，按照公式：病毒濃度＝熒光細胞數/該孔病毒原液體積來計算病毒滴度。
9、(3)t細胞制備：分離外周血的單個核細胞，進行培養獲得t細胞。
10、(4)cd105-pd-1/nb?car-t細胞：用含有人cd3單克隆抗體、人cd28單克隆抗體和人il-2細胞因子的專用t細胞培養基培養t細胞24小時。次日，按照moi?20將慢病毒液加入以上刺激后的t細胞中，在37℃co2培養箱培養48h，將car-t細胞置于普通顯微鏡下，觀察car-t細胞的增強綠色熒光蛋白(egfp)的表達情況。
11、如上述的制備方法，在所述步驟(4)中，待慢病毒感染后的t細胞的細胞量占培養瓶80-90％時將細胞收集換液，加入終濃度為100u/ml的il-2的完全培養液進行擴增培養，采用流式細胞儀對感染的細胞進行鑒定。
12、如上述的制備方法，其中所述car-t細胞是采用慢病毒感染技術進行制備的。
13、一種所述的分泌pd-1單域抗體靶向cd105的car-t細胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的應用。
14、如本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種分泌PD-1單域抗體靶向CD105的CAR-T細胞，其特征在于，所述CAR-T細胞是嵌合抗原受體CD105?Nb-HIStag-CD8-CD137-CD3ζ-PD-1Nb修飾的T細胞，所述嵌合抗原受體CD105?Nb-HIStag-CD8-CD137-CD3ζ-PD-1Nb的核苷酸序列包含如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的CAR-T細胞，其中所述嵌合抗原受體CD105Nb-HIStag-CD8-CD137-CD3ζ-PD-1Nb的核苷酸序列為如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。
3.一種如權利要求1所述的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：設計CAR目的序列，通過PCR法獲得CD105Nb-HIStag-CD8-CD137-CD3ζ-2A-PD-1Nb的CAR目的序列片段，將酶切后的慢病毒載體與PCR法得到的CAR目的序列重組，將重組后的慢病毒載體轉化至大腸桿菌中，并且篩選陽性克隆菌，進行陽性克隆菌測序驗證是否成功構建含有CD105/PD-1Nb?CAR序列的慢病毒載體，對測序成功的重
4.一種如權利要求3所述的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
5.如權利要求4所述的制備方法，其中在步驟(4)中，待慢病毒感染后的T細胞的細胞量占培養瓶80-90％時將細胞收集換液，加入終濃度為100U/mL的IL-2的完全培養液進行擴增培養，采用流式細胞儀對感染的細胞進行鑒定。
6.一種權利要求1或2所述的分泌PD-1單域抗體靶向CD105的CAR-T細胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其中所述的腫瘤是指CD105陽性腫瘤。
8.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如權利要求1或2所述的CAR-T細胞和藥學上可接受的載體。
9.一種編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列，其中所述嵌合抗原受體為CD105Nb-HIStag-CD8-CD137-CD3ζ-PD-1Nb，所述核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。
10.一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為CD105?Nb-HIStag-CD8-CD137-CD3ζ-PD-1Nb，所述嵌合抗原受體由如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列編碼。
...【技術特征摘要】
1.一種分泌pd-1單域抗體靶向cd105的car-t細胞，其特征在于，所述car-t細胞是嵌合抗原受體cd105?nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb修飾的t細胞，所述嵌合抗原受體cd105?nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb的核苷酸序列包含如seq?id?no.1所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的car-t細胞，其中所述嵌合抗原受體cd105nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb的核苷酸序列為如seq?id?no.1所示的核苷酸序列。
3.一種如權利要求1所述的car-t細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：設計car目的序列，通過pcr法獲得cd105nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-2a-pd-1nb的car目的序列片段，將酶切后的慢病毒載體與pcr法得到的car目的序列重組，將重組后的慢病毒載體轉化至大腸桿菌中，并且篩選陽性克隆菌，進行陽性克隆菌測序驗證是否成功構建含有cd105/pd-1nb?car序列的慢病毒載體，對測序成功的重組陽性克隆菌株提取質粒，轉染待轉染細胞后通過rt-pcr鑒定cd105/pd-1nb?car序列細胞中表達情況，驗證重組慢病...
【專利技術屬性】
技術研發人員：盧小玲，黃夏寧，于子航，劉詩權，謝深霞，孫樹陽，
申請(專利權)人：廣西醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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