【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及一種分子改造的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶ao-190mut及其制備方法，屬生物。
技術介紹
1、食線蟲性真菌（nematophagous?fungi，ntf）對維持土壤生態(tài)系統(tǒng)中線蟲的動態(tài)平衡起著重要作用。目前，已發(fā)現(xiàn)不同種類的食線蟲性真菌約700種，它們能夠捕捉線蟲（幼蟲，成蟲和蟲卵），并將其作為自身的營養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)對線蟲的作用機制，通常將食線蟲性真菌分為4大類：即捕食線蟲性真菌、內(nèi)寄生性真菌、機會真菌以及產(chǎn)毒素殺線蟲性真菌。目前，化學驅(qū)蟲藥物的廣泛使用已造成諸多問題，如線蟲產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留、生態(tài)環(huán)境污染等，因此利用線蟲的天敵--捕食線蟲性真菌及其侵染性蛋白酶研發(fā)殺線蟲的新型生物防控制劑具有重要的應用前景。
2、捕食線蟲性真菌不僅可以捕捉線蟲作為自身的營養(yǎng)物質(zhì)，而且對維持天然環(huán)境中線蟲種群密度的動態(tài)平衡起重要的作用。捕食線蟲性真菌對環(huán)境的適應性和靈活的生活方式使其成為防控動物寄生線蟲的理想生物制劑。捕食線蟲性真菌是通過孢子、菌絲或菌絲末端侵染線蟲、蟲卵或囊胞的一類殺線蟲性真菌。該類真菌主要分布于真菌界（ eumycota）的子囊菌門（ ascomycota）、擔子菌門（ basidioymcota）、接合菌門（ zygomycota）等，大多屬于節(jié)叢孢屬（ arthrobotrys）、掘氏霉屬（ drechslerella）、亞隔指孢屬（
3、幾丁質(zhì)（chitin）是線蟲體壁和蟲卵外殼的重要組成部分，由n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成的高分子生物多聚體，其結(jié)構(gòu)堅硬，在線蟲和蟲卵抵抗外界不良環(huán)境過程中起關鍵性作用。在捕食線蟲過程中，捕食線蟲性真菌可分泌一些水解酶（幾丁質(zhì)酶、絲氨酸蛋白酶和膠原蛋白酶等），其中幾丁質(zhì)酶能破壞幾丁質(zhì)中的β-1，4糖苷鍵，并將線蟲體壁或蟲卵卵殼水解成n-乙酰基-β-d-葡萄糖，因此幾丁質(zhì)酶在真菌穿透、附植和消化線蟲過程中發(fā)揮了重要的作用。
4、目前，根據(jù)氨基酸序列的同源性可將幾丁質(zhì)酶分為ⅰ～ⅴ種類型，其中ⅰ、ⅱ、ⅳ型屬于幾丁質(zhì)酶19家族，主要存在于高等植物中，而ⅲ、ⅴ型屬于幾丁質(zhì)酶18家族，主要存在于植物和真菌中。根據(jù)酶與底物發(fā)生反應的不同位置、降解后產(chǎn)生的產(chǎn)物可以將幾丁質(zhì)酶劃分為以下三類：（1）幾丁質(zhì)內(nèi)切酶（endochitinase，ec3.2.1.14）：沿著幾丁質(zhì)鏈隨機進行切割糖苷鍵，生成二聚體（二乙酰基殼二糖）和由?glcnac?組成的可溶性低分子量多聚體，如殼三糖和殼寡糖。（2）幾丁質(zhì)外切酶（exochitinase）：可從糖鏈的非還原端開始裂解幾丁質(zhì)或幾丁質(zhì)寡聚物，生成單體?n-乙酰葡糖胺(glcnac)，也是唯一能水解(glcnac)2?的酶。（3）裂解多糖單加氧酶（lpmo）：屬于具有水解多糖能力的糖苷水解酶，隸屬于糖苷水解酶家族（glycoside?hydrolase?family）。
5、?雖然不同真菌來源的幾丁質(zhì)酶在氨基酸序列上存在較大差異，但大多數(shù)幾丁質(zhì)酶具有相似的結(jié)構(gòu)域，從n端到c端依次為：信號肽（signal?peptide，sp）、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（chitin-binding?domain，cbd）、催化結(jié)構(gòu)域（catalyticdomain）、插入結(jié)構(gòu)域（insertion?domain，cid）和lysm結(jié)構(gòu)域（lysm?domain）等。少孢節(jié)叢孢菌是捕食線蟲性真菌的代表菌之一，也是目前分子生物學背景研究最為深入的捕食線蟲性真菌。研究發(fā)現(xiàn)，少孢節(jié)叢孢菌在侵染和降解線蟲過程中，可產(chǎn)生多種幾丁質(zhì)酶（至少16種），它們在分子結(jié)構(gòu)和生物學功能方面存在著差異。幾丁質(zhì)酶在水解幾丁質(zhì)的過程中，催化結(jié)構(gòu)域起關鍵性作用。同源性比較發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶具有高度保守的催化域區(qū)段lisxggw和dxxdxdxe，然而在保守催化域中的glu對催化反應至關重要。此外，在不同營養(yǎng)環(huán)境中少孢節(jié)叢孢菌不同的幾丁質(zhì)酶表達水平也存在明顯的差異。相關研究表明，幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cbd）主要存在一個能夠與非溶性幾丁質(zhì)結(jié)合的位點，可增強真菌幾丁質(zhì)酶對非溶性幾丁質(zhì)的水解，使幾丁質(zhì)酶的水解功能增強。
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術提供了一種分子改造的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶ao-190mut及其制備方法，利用expasy分子生物學軟件對少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶ao-190和ao-223基因及其編碼蛋白進行分子結(jié)構(gòu)特征分析。在保留了幾丁質(zhì)酶ao-190幾丁質(zhì)酶保守域的基礎上，為增加其幾丁質(zhì)結(jié)合能力，在其n端用連續(xù)的3段柔性肽[（gggggs）3]連接幾丁質(zhì)酶ao-223幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建ao-190mut融合基因片段，以確保各結(jié)構(gòu)域功能獨立發(fā)揮生物學功能。同時，依據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性，?將該基因片段中編碼精氨酸（arg）的畢赤酵母稀有密碼子（使用頻率低的cgc、cga、cgg、agg）全部突變?yōu)楫叧嘟湍钙珢勖艽a子（使用頻率高的aga），構(gòu)建出幾丁質(zhì)酶ao-190mut突變基因。將分子改造后的ao-190mut基因在畢赤酵母中進行高效表達，制備出可分解幾丁質(zhì)的高酶學活性的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶ao-190mut，為草食動物線蟲病新型生物防控制劑的研發(fā)提供制備方法。
2、利用expasy分子生物學軟件對少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶ao-190和ao-223基因及其編碼蛋白序列分析，保留了幾丁質(zhì)酶ao-190幾丁質(zhì)酶保守域，同時為增加幾丁質(zhì)結(jié)合能力，在其n端用3段連續(xù)的柔性肽[（gggggs）3]連接幾丁質(zhì)酶ao-223幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（xm_011129025，幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域cbd1和cbd2），以保證各保守域功能獨立，此外，依據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性，將畢赤酵母中編碼arg使用頻率極低的密碼子?cgc、cga、cgg、agg突變?yōu)槭褂妙l率高的aga。將改造后的幾丁質(zhì)酶基因命名為?ao-190mut，經(jīng)畢赤酵母偏好密碼子優(yōu)化，進行ao-190mut全長基因的生物合成。在此基礎上，將人工改造的ao-190mut基因克隆入ppiczαa真核表達載體中，并將其轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細胞gs115中，用甲醇進行誘導表達。通過sds-page和western?blot分析和鑒定表達產(chǎn)物，并用鎳離子親和層析法純化出重組蛋白，制備出可分解幾丁質(zhì)的高酶學活性的少孢節(jié)叢孢菌重組幾丁質(zhì)酶ao-190mut。
3、本專利技術主要涉及以下幾個方面的內(nèi)容：少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶ao-190和ao-223基因的擴增、克隆及序列分析，少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶ao-190mut基因的分子改造及人工合成，少孢節(jié)叢孢菌-ao-190mut基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定，少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶ao本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.一種分子改造的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-190mut的制備方法，其特征在于：
2.如權(quán)利要求1所述的分子改造的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-190mut的制備方法，其特征在于：
3.如權(quán)利要求1所述的分子改造的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-190mut的制備方法，其特征在于：所述的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-190mut分子改造及人工合成的基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
4.一種分子改造的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-190mut，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法制備。
【技術特征摘要】
1.一種分子改造的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶ao-190mut的制備方法，其特征在于：
2.如權(quán)利要求1所述的分子改造的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶ao-190mut的制備方法，其特征在于：
3.如權(quán)利要求1所述的分子改造的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶ao-1...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：喬軍，孟慶玲，張慧梅，
申請(專利權(quán))人：石河子大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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