一種基于ABEI/Co2+/GO@DNA水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基于ABEI/Co<supgt;2+</supgt;/GO@DNA水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器及其應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器包括適配體?引物復(fù)合物、環(huán)狀模板、二級引物、Phi29DNA聚合酶、dNTPs、ABEI/Co2+/GO和目標(biāo)物。本發(fā)明專利技術(shù)通過ABEI/Co<supgt;2+</supgt;/GO加速DNA水凝膠的形成，進而利用DNA水凝膠延緩反應(yīng)物擴散以延長化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時間，制備了輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，有效克服了閃光型化學(xué)發(fā)光的缺陷，為鼠傷寒沙門氏菌的現(xiàn)場快速檢測提供諸多便利。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及食品安全檢測，具體涉及一種基于abei/co2+/go@dna水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器及其應(yīng)用。

技術(shù)介紹

1、鼠傷寒沙門氏菌，作為一種普遍存在的食源性病原體，嚴(yán)重威脅著公眾健康，能夠潛在地引發(fā)急性腸胃炎乃至敗血癥等嚴(yán)重疾病。鑒于此，實現(xiàn)對食品中該菌種的高效、精準(zhǔn)且快速的檢測顯得尤為重要。盡管微生物培養(yǎng)法因其原理直觀、技術(shù)成熟且檢測準(zhǔn)確性高，已被確立為我國國家標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定使用的檢測方法，但其顯著的局限性在于檢測周期冗長，通常需要3-5天才能完成，這明顯滯后于現(xiàn)代食品安全管理中對食源性致病菌快速響應(yīng)的需求。因此，探索并開發(fā)高靈敏度、高準(zhǔn)確性且能在更短時間內(nèi)完成檢測的新技術(shù)，對于提升食品安全檢測效率、保障公眾健康具有迫切意義。

2、基于現(xiàn)有檢測方法的局限性，化學(xué)發(fā)光生物傳感器由于響應(yīng)速度快、無需外部光源激發(fā)等優(yōu)勢在食源性致病菌檢測領(lǐng)域備受關(guān)注。然而，大多數(shù)化學(xué)發(fā)光底物，如魯米諾、吖啶酯等，均呈現(xiàn)閃光型化學(xué)發(fā)光，即發(fā)光和湮滅在幾秒內(nèi)完成，瞬時發(fā)光特性往往會導(dǎo)致較差的檢測精度和重現(xiàn)性。

3、dna水凝膠是dna鏈在溶液中高度交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。利用其致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠有效延緩化學(xué)發(fā)光反應(yīng)物的擴散，進而延長化學(xué)發(fā)光時間，將閃光型化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)變?yōu)檩x光型化學(xué)發(fā)光。目前，已有基于dna水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器的報道，然而，這些dna水凝膠多依賴于大量短dna鏈之間的堿基互補配對作用而形成。這種化學(xué)合成的dna需要高純度的原材料和專業(yè)的儀器設(shè)備，由此導(dǎo)致的較高的dna合成成本限制了其在分析檢測領(lǐng)域的進一步推廣與應(yīng)用。

4、滾環(huán)擴增(rca)技術(shù)是一種等溫核酸放大技術(shù)，憑借其dna序列設(shè)計的靈活性與反應(yīng)條件的恒溫性，已成為構(gòu)建dna水凝膠的理想平臺。該技術(shù)生成的ssdna鏈富含由rca模板互補序列串聯(lián)而成的重復(fù)單元，賦予了dna水凝膠功能性和個性化定制潛力。根據(jù)檢測對象的適配體序列，設(shè)計相應(yīng)的引物和rca反應(yīng)模板序列，利用適配體、引物和目標(biāo)物之間的競爭性結(jié)合作用，可在目標(biāo)物誘導(dǎo)下，生成dna水凝膠，輔以相應(yīng)的檢測信號輸出，進而實現(xiàn)目標(biāo)物的靈敏檢測。然而，rca產(chǎn)物dna水凝膠的形成通常需要24～72h，較長的成膠時間為現(xiàn)場快速檢測帶來諸多不便，無法滿足鼠傷寒沙門氏菌的現(xiàn)場快速檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供了一種基于abei/co2+/go@dna水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器及其應(yīng)用。本專利技術(shù)通過abei/co2+/go加速dna水凝膠的形成，進而利用dna水凝膠延緩反應(yīng)物擴散以延長化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時間，制備了輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，有效克服了閃光型化學(xué)發(fā)光的缺陷，為鼠傷寒沙門氏菌的現(xiàn)場快速檢測提供諸多便利。

2、本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：

3、一種基于abei/co2+/go@dna水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器包括適配體-引物復(fù)合物、環(huán)狀的模板、二級引物、phi29?dna聚合酶、dntps、abei/co2+/go和目標(biāo)物；

4、所述適配體-引物復(fù)合物中適配體序列如seq?no.1所示，引物序列如seq?no.2所示；

5、所述模板序列如seq?no.3所示；

6、所述二級引物序列如seq?no.4所示。

7、進一步地，所述abei/co2+/go的制備方法為：

8、(1)將abei溶液與go溶液混合，于25℃、1000rpm條件下避光震蕩孵育12h，得到abei/go；

9、(2)然后加入氯化鈷溶液，于25℃、1000rpm條件下避光震蕩孵育3h，于12500rpm條件下離心20min、棄上清，經(jīng)超純水洗滌，復(fù)溶，得到abei/co2+/go。

10、進一步地，步驟(1)中，所述abei溶液的配置方法為：將27.633mg的abei溶解于10ml濃度為0.1mol/l的naoh溶液中；所述go溶液的配置方法為：將0.1mg?go溶解于1ml純水中，于400w超聲處理1h；所述abei溶液與go溶液的體積比為0.1:1。

11、進一步地，步驟(2)中，所述氯化鈷溶液的配置方法為：將237.9mg六水合氯化鈷溶解并定容于100ml純水中；所述氯化鈷溶液與go溶液的體積比為0.25:1。

12、進一步地，所述適配體-引物復(fù)合物的制備方法為：

13、(1)將20μl?10μmol/l的適配體與20μl?10μmol/l引物于pcr管中混合均勻，置于pcr儀中，在95℃下退火10min，然后緩慢冷卻以獲得適配體-引物復(fù)合物；

14、(2)向其中加入14μl?5u/μl的核酸外切酶ⅰ以酶解未結(jié)合的dna單鏈，制備得到純化后的適配體-引物復(fù)合物。

15、進一步地，所述環(huán)狀的模板制備方法如下：

16、(1)將30μl?20μmol/l的成環(huán)引物與鏈狀的模板混合均勻，采用梯度降溫法進行雜交，得到模板的環(huán)狀dna前體；

17、所述成環(huán)引物序列如seq?no.5所示；

18、(2)再加入7.5μl?400u/μl的t4?dna連接酶，在37℃下孵育2h，并在65℃下孵育10min滅酶；然后依次加入10μl?5u/μl的exoⅰ酶、5μl?200u/μl的exoⅲ酶，先在37℃孵育1h，然后在80℃下孵育20min，得到純化后的環(huán)狀的模板。

19、一種所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器的應(yīng)用，所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器用于檢測鼠傷寒沙門氏菌。

20、進一步地，使用所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法包括如下步驟：

21、(1)制備abei/co2+/go@dna水凝膠；

22、(2)向abei/co2+/go@dna水凝膠中加入100μl?0.01mol/l的h2o2溶液中反應(yīng)1min后，拍攝發(fā)光圖像，并使用image?j軟件分析其rgb值，將rgb值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測樣品中目標(biāo)物鼠傷寒沙門氏菌的濃度。

23、進一步地，步驟(1)中，所述abei/co2+/go@dna水凝膠的制備方法為：

24、(1)取54μl制備的適配體-引物復(fù)合物，加入246μl待測目標(biāo)物，于37℃、600rpm條件下震蕩孵育45min，使適配體識別并結(jié)合目標(biāo)物，然后經(jīng)0.22μm的濾膜過濾，收集濾液，得到游離的引物；

25、(2)取30μl游離的引物，與15μl?3μmol/l二級引物、3μl環(huán)狀模板、2.5μl?25mmol/l的dntps、1μl純水、6μl?10×phi29?dna聚合酶反應(yīng)緩沖液和2.5μl?10u/μl的phi29?dna聚合酶充分混合，于37℃，800rpm下孵育25min；然后加入15μl?abei/co2+/go，于37℃，1050rpm下孵育10min，得到abei/co2+/go@dna水凝膠。

26、進一步地，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝49.24+1.本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

1.一種基于ABEI/Co2+/GO@DNA水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于，所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器包括適配體-引物復(fù)合物、環(huán)狀的模板、二級引物、Phi29?DNA聚合酶、dNTPs、ABEI/Co2+/GO和目標(biāo)物；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于，所述ABEI/Co2+/GO的制備方法為：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于，步驟(1)中，所述ABEI溶液的配置方法為：將27.633mg的ABEI溶解于10mL濃度為0.1mol/L的NaOH溶液中；所述GO溶液的配置方法為：將0.1mg?GO溶解于1mL純水中，于400W超聲處理1h；所述ABEI溶液與GO溶液的體積比為0.1:1。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于，步驟(2)中，所述氯化鈷溶液的配置方法為：將237.9mg六水合氯化鈷溶解并定容于100mL純水中；所述氯化鈷溶液與GO溶液的體積比為0.25:1。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于，所述適配體-引物復(fù)合物的制備方法為：

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于，所述環(huán)狀的模板制備方法如下：

7.一種權(quán)利要求1-6任一項所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器的應(yīng)用，其特征在于，所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器用于檢測鼠傷寒沙門氏菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，使用所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法包括如下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(1)中，所述ABEI/Co2+/GO@DNA水凝膠的制備方法為：

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y＝49.24+1.34*X，R2＝0.9942，其中Y表示RGB值，X表示鼠傷寒沙門氏菌的濃度的對數(shù)值。

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【技術(shù)特征摘要】

1.一種基于abei/co2+/go@dna水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于，所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器包括適配體-引物復(fù)合物、環(huán)狀的模板、二級引物、phi29?dna聚合酶、dntps、abei/co2+/go和目標(biāo)物；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于，所述abei/co2+/go的制備方法為：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于，步驟(1)中，所述abei溶液的配置方法為：將27.633mg的abei溶解于10ml濃度為0.1mol/l的naoh溶液中；所述go溶液的配置方法為：將0.1mg?go溶解于1ml純水中，于400w超聲處理1h；所述abei溶液與go溶液的體積比為0.1:1。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于，步驟(2)中，所述氯化鈷溶液的配置方法為：將237.9mg六水合氯化鈷溶解并定容于10...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：郝麗玲，徐斐，李夢秋，葉泰，曹慧，袁敏，陰鳳琴，
申請(專利權(quán))人：上海理工大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：