【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本領(lǐng)域涉及glp-1檢測(cè)，特別涉及一種測(cè)定利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法。
技術(shù)介紹
1、利拉魯肽，英文名稱為liraglutide，是由丹麥諾和諾德公司開發(fā)生產(chǎn)的一種新型長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類似物，用于治療ii型糖尿病。利拉魯肽具有降血糖、減肥、降低糖尿病患者主要不良心血管事件風(fēng)險(xiǎn)的功效，最早于2007年9月在歐盟批準(zhǔn)上市。
2、利拉魯肽將人體glp-1(7-36)的lys34替換成arg，并且在lys26側(cè)鏈上連接一條16碳棕櫚脂肪酸衍生而來(lái)。化學(xué)合成的利拉魯肽為31肽，分子式為c172h265n43o51，分子量為3751.20g/mol。外觀為白色至類白色粉末或疏松塊狀物。肽序列為：
3、h-his1-ala2-glu3-gly4-thr5-phe6-thr7-ser8-asp9-val10-ser11-ser12-tyr13-leu14-glu15-gly16-gln17-ala18-ala19-lys20(n-ε-(γ-glu(n-α-pal))-glu21-phe22-ile23-ala24-trp25-leu26-val27-arg28-gly29-arg30-gly31-oh。
4、多肽主要由氨基酸(包括天然氨基酸和非天然氨基酸)構(gòu)成，這使得多肽類藥物在質(zhì)量研究方面不同于一般藥物。由于合成工藝、結(jié)構(gòu)等方面的獨(dú)特性，合成多肽原料藥中工藝雜質(zhì)的來(lái)源和一般化學(xué)藥物有所不同，其可能產(chǎn)生的工藝雜質(zhì)有：缺失肽、錯(cuò)接肽、斷裂肽、去酰胺多肽、氨基酸側(cè)鏈的不完全脫保護(hù)所形
5、化學(xué)合成的利拉魯肽，在合成及儲(chǔ)存過(guò)程中，不可避免地產(chǎn)生一系列的工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)，如[d-ser12]雜質(zhì)(雜質(zhì)a)、[d-his1]雜質(zhì)(雜質(zhì)d)、[d-ser8]雜質(zhì)(雜質(zhì)b)，[ile26]雜質(zhì)(雜質(zhì)f)，[des-his1-ala2]雜質(zhì)(雜質(zhì)e)。其中雜質(zhì)a、雜質(zhì)d、雜質(zhì)b、雜質(zhì)f在工藝過(guò)程中產(chǎn)生，因這些雜質(zhì)與利拉魯肽在結(jié)構(gòu)上僅有一個(gè)氨基酸不同，其性質(zhì)與利拉魯肽極其相近，純化難以去除；同時(shí)因利拉魯肽呈堿性，在存放過(guò)程中容易發(fā)生消旋，產(chǎn)生雜質(zhì)a、雜質(zhì)d、雜質(zhì)b、雜質(zhì)e，所以在利拉魯肽的原料藥與制劑中需要嚴(yán)格控制雜質(zhì)含量，否則，一旦這些雜質(zhì)超出限度將影響藥品的質(zhì)量，帶來(lái)藥品安全風(fēng)險(xiǎn)。然而這些雜質(zhì)或?yàn)槔旊南s質(zhì)、缺失肽雜質(zhì)或錯(cuò)接肽雜質(zhì)，在性質(zhì)上與利拉魯肽極為接近，較難與主峰分離，對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定存在一定難度，因此，需要開發(fā)一種能有效分離這些雜質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定的方法。目前，沒(méi)有任何藥典收載利拉魯肽有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，現(xiàn)有專利及文獻(xiàn)對(duì)于利拉魯肽有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法的報(bào)道較少，中國(guó)專利cn107290438a提供了一種利拉魯肽有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，但該方法未涉及任何特定雜質(zhì)的分離，且主峰拖尾因子大于2.0，拖尾嚴(yán)重。
6、由于這些有關(guān)雜質(zhì)的毒理數(shù)據(jù)尚不明確，對(duì)于患者用藥必然存在一定的潛在的風(fēng)險(xiǎn)。因此，為了保證利拉魯肽產(chǎn)品質(zhì)量，提高患者用藥安全性，對(duì)利拉魯肽中這些特定雜質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制具有非常重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種測(cè)定利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，在特定的色譜條件下，能夠同時(shí)有效分離利拉魯肽及5種特定雜質(zhì)，并對(duì)利拉魯肽及其雜質(zhì)含量進(jìn)行定量測(cè)定，且靈敏度高，能有效控制利拉魯肽產(chǎn)品的質(zhì)量。
2、為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的目的，本專利技術(shù)提供了一種測(cè)定利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，包括以下步驟：
3、采用c8色譜柱；以磷酸鹽緩沖溶液-乙腈的混合溶液，并調(diào)ph至4.8～5.0，作為流動(dòng)相；洗脫方式：梯度洗脫。
4、所述特定雜質(zhì)包括：雜質(zhì)a、雜質(zhì)b、雜質(zhì)d、雜質(zhì)e、雜質(zhì)f，肽序如下：
5、雜質(zhì)a：h-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-d-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-ieu-val-arg-gly-arg-gly-oh
6、雜質(zhì)b：h-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-d-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh
7、雜質(zhì)d：h-d-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh
8、雜質(zhì)e：h-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh
9、雜質(zhì)f：h-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-ile-val-arg-gly-arg-gly-oh
10、本專利技術(shù)中，色譜柱為c8色譜柱。不同填料的色譜柱，對(duì)雜質(zhì)分離有著極其重要的影響，甚至影響雜質(zhì)的出峰順序。優(yōu)選色譜柱規(guī)格為250×4.6mm，填料粒徑為3～3.5μm，相比較粒徑為5μm的色譜柱而言，粒徑更小，理論塔板數(shù)更高，對(duì)改善峰型及提高分離度更有利。
11、本專利技術(shù)中，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液-乙腈混合溶液。不同的緩沖鹽體系對(duì)主峰及雜質(zhì)的分離效果不一樣，同時(shí)對(duì)主峰峰型及基線有不同程度的影響，如主峰前沿或拖尾則無(wú)法判斷雜質(zhì)是否與與主峰分離，以磷酸鹽緩沖溶液-乙腈為流動(dòng)相體系，雜質(zhì)的分離效果好，主峰峰型好。根據(jù)本專利技術(shù)的一些優(yōu)選實(shí)施方式，所述流動(dòng)相中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為10～50mmol/l。由于使用的緩沖鹽濃度包含高濃度范疇，因此本專利技術(shù)在流動(dòng)相中預(yù)先混入一定比例的乙腈，此操作有利于儀器平衡使基線波動(dòng)更穩(wěn)定。
12、本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施例中，流動(dòng)相ph范圍為4.8～5.0。不同ph能改變前后雜質(zhì)與主峰的分離度，甚至影響雜質(zhì)的出峰順序，其中，ph在4.8～5.0時(shí)主峰與前后雜質(zhì)的分離能達(dá)到良好的分離效果，主峰峰形本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種測(cè)定利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述C8色譜柱規(guī)格為250×4.6mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述流動(dòng)相包括流動(dòng)相A、B，其中流動(dòng)相A為磷酸鹽緩沖溶液-乙腈(3:2)的混合溶液，流動(dòng)相B為磷酸鹽緩沖溶液-乙腈(1:1)的混合溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀或磷酸二氫銨。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖溶液的濃度為10～50mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖溶液的濃度為30mmol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述流動(dòng)相的pH值為4.9。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述色譜條件中色譜柱柱溫為45℃。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述色譜條件中流速為0.7～0.9ml/min。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述色譜條件中流速為0.8ml/min。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述色譜條件中檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述洗脫梯度為流動(dòng)相B：26±2％→72±2％(0-60min)→72±2％(60-90min)。
14.權(quán)利要求1-13任一所述方法在利拉魯肽原料藥和制劑有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求1-13任一所述方法在利拉魯肽含量檢測(cè)中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種測(cè)定利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述c8色譜柱規(guī)格為250×4.6mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述流動(dòng)相包括流動(dòng)相a、b，其中流動(dòng)相a為磷酸鹽緩沖溶液-乙腈(3:2)的混合溶液，流動(dòng)相b為磷酸鹽緩沖溶液-乙腈(1:1)的混合溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀或磷酸二氫銨。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖溶液的濃度為10～50mmol/l。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖溶液的濃度為30mmol/l。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，其特征在于，所述流動(dòng)相的ph值為4.9。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李新宇，章濤，付菜花，張利香，付玉清，馬洪季，岳澤樂(lè)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：深圳市健元醫(yī)藥科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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