【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及植物病理學，具體為一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法。
技術介紹
1、芝麻作為一種重要的油料作物，在全球范圍內廣泛種植，但是芝麻枯萎病的頻繁發生給芝麻的產量和品質帶來了嚴重威脅，芝麻枯萎病是由多種病原菌引起的病害，其發病過程復雜，早期癥狀不明顯，一旦病情加重，往往會導致芝麻植株大面積死亡，給種植戶帶來巨大的經濟損失，因此，準確、快速地鑒定芝麻枯萎病對于及時采取防治措施、保障芝麻生產至關重要。
2、然而，在芝麻枯萎病的鑒定方法中，傳統的形態學觀察和病原菌分離培養方法，在形態學觀察往往依賴于經驗豐富的專業人員，主觀性較強，且在病害早期難以準確判斷，病原菌分離培養則耗時較長，操作復雜，容易受到環境因素的干擾，而現有的基于分子標記的鑒定方法，大多采用常規的dna片段或短鏈rna作為分子標記，這些分子標記在特異性和靈敏度方面存在不足，與其他病害和非病害狀態下的芝麻植株存在一定的交叉反應，導致誤判，同時，傳統的鑒定方法通常采用已知的蛋白質編碼基因作為標記，這些方法往往不能精確地反映疾病的早期狀態。
3、綜上所述，現有的芝麻枯萎病鑒定方法難以滿足實際生產中對芝麻枯萎病快速、精準鑒定的需求，因此，開發一種新的基于特定長鏈非編碼rna作為分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法具有重要的現實意義，為芝麻枯萎病的防治提供更加可靠的技術支持。
技術實現思路
1、本專利技術的目的就是為了彌補現有技術的不足，提供了一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，它能夠通過采用特定長鏈非編碼
2、本專利技術為解決上述技術問題，提供如下技術方案：一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，該鑒定方法包括以下步驟：
3、s100，rna提取與純化：從待測芝麻樣本中提取總dna和蛋白質污染rna，采用高效的rna提取試劑盒，對提取的rna進行純化，通過去除存在的雜質和抑制劑，以保證后續反轉錄和pcr擴增的效率；
4、s200，反轉錄與cdna合成：利用反轉錄試劑盒，將純化后的rna反轉錄為cdna，在反轉錄過程中，使用針對lncrna-x123設計的特異性引物和酶，對合成的cdna進行質量檢測和濃度測定，通過電泳法，使其滿足pcr擴增的要求；
5、s300，pcr擴增與產物檢測：合成針對特定lncrna的引物對準確擴增出目標lncrna片段，以cdna為模板，利用特定的引物對進行pcr擴增，通過優化pcr反應條件，對擴增產物進行質量檢測，包括產物大小、純度和濃度；
6、s400，測序與數據分析：對擴增產物進行測序，得到特定lncrna的序列信息，與已知的芝麻枯萎病相關lncrna序列進行比對和分析，對測序結果進行質量控制，以得到準確的鑒定結果；
7、s500，鑒定結果判斷：根據比對結果，判斷待測芝麻樣本是否感染枯萎病，測序結果與已知的芝麻枯萎病相關lncrna序列一致，則判斷待測芝麻樣本感染枯萎病，并設置多個特定的lncrna分子標記進行聯合鑒定，檢驗鑒定的靈敏度和特異性。
8、更進一步地，所述s100的具體步驟為：
9、s101，樣本準備與組織破壞：選取健康的和已知感染枯萎病的芝麻植株作為待測樣本，迅速冷凍保存在液氮中，將冷凍的芝麻組織取出，在液氮中研磨成粉末狀；
10、s102，rna提取：使用rna提取試劑盒trizol試劑，加入裂解液到研磨后的組織中，使細胞裂解并釋放出rna，通過離心操作去除細胞碎片和不溶物，得到含有rna的上清液，使用紫外分光光度計測定rna濃度和純度；
11、s103，去除dna污染：在上清液中加入dna酶，以去除殘留的dna，通過熱失活和加入抑制劑方法使dna酶失活；
12、s104，rna純化：使用柱狀純化試劑盒進一步純化rna，去除提取過程中產生的雜質和抑制劑，通過紫外分光光度計再次測定純化后的rna濃度和純度；
13、s105，rna沉淀與洗滌：加入異丙醇和乙醇沉淀劑，使rna沉淀下來，通過離心收集rna沉淀，并用75％乙醇洗滌以去除殘留的鹽和小分子雜質。
14、更進一步地，所述s100rna提取與純化通過紫外分光光度計測定rna的a260/a280比值和a260/a230比值，以評估rna的純度，其中，對于a260/a280比值接近2.0，a260/a230比值接近2.0-2.2時，認為rna質量良好，將提取和純化后的rna儲存在-80℃條件下，以防止rna降解并為反轉錄和pcr擴增使用。
15、更進一步地，所述s200反轉錄與合成的具體步驟為：
16、s201，反轉錄體系準備：根據反轉錄試劑盒準備反轉錄所需的反應體系，包括反轉錄酶、針對lncrna-x123設計特異性引物、rna酶抑制劑、脫氧核糖核苷三磷酸以及緩沖液；
17、s202，rna模板加入：將純化后并經過質量評估的rna樣本加入到反轉錄體系中；
18、s203，反轉錄反應：對含有rna模板的反轉錄體系設置反應條件，進行反轉錄反應，使rna完全反轉錄為cdna；
19、s204，cdna質量評估與濃度測定：對反轉錄得到的cdna進行初步的質量評估，使用分光光度計測定cdna的濃度，同時，利用瓊脂糖凝膠電泳觀察cdna的完整性和大小分布，檢查是否有降解和非特異性產物的存在；
20、s205，cdna存儲：將質量合格的cdna樣本存儲在-20℃，以防止降解并備pcr擴增使用。
21、更進一步地，所述s203反轉錄反應將純化后的rna樣品與特異性引物混合，并按照反轉錄試劑盒加入反轉錄酶，設置反轉錄反應條件為65℃，預熱為5分鐘以使rna變性，隨后置于冰上冷卻，進行反轉錄反應設置反應溫度和時間為42℃和1小時，并70℃加熱15分鐘以終止反應，通過s204使用紫外分光光度計測定cdna的濃度和純度，使cdna的a260/a280比值接近2.0，即cdna純度較高，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查cdna的質量，確保沒有降解現象。
22、更進一步地，所述s300pcr擴增與產物檢測的具體步驟為：
23、s301，pcr反應體系準備：在無菌的pcr管中，依次加入cdna模板、特異性引物對、dna聚合酶、緩沖液、dntps和無菌水，組成pcr反應體系；
24、s302，pcr反應條件設置：根據引物和dna聚合酶的特性，設置pcr反應條件，包括預變性溫度和時間、變性溫度和時間、退火溫度和時間、延伸溫度和時間以及循環次數；
25、s303，pcr擴增反應：將pcr反應體系放入pcr儀中，設定的反應條件進行擴增反應，觀察pcr本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，該鑒定方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述S100的具體步驟為：
3.根據權利要求2所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述S100RNA提取與純化通過紫外分光光度計測定RNA的A260/A280比值和A260/A230比值，以評估RNA的純度，其中，對于A260/A280比值接近2.0，A260/A230比值接近2.0-2.2時，認為RNA質量良好，將提取和純化后的RNA儲存在-80℃條件下，以防止RNA降解并為反轉錄和PCR擴增使用。
4.根據權利要求1所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述S200反轉錄與合成的具體步驟為：
5.根據權利要求4所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述S203反轉錄反應將純化后的RNA樣品與特異性引物混合，并按照反轉錄試劑盒加入反轉錄酶，設置反轉錄反應條件為65℃，預熱為5分鐘以使RNA變性，隨后置于冰上冷卻，進行反轉錄反應設置反
6.根據權利要求1所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述S300PCR擴增與產物檢測的具體步驟為：
7.根據權利要求6所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述S303PCR擴增反應設置PCR擴增條件為94℃預變性5分鐘、94℃變性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分鐘、重復35個循環、以72℃延伸5分鐘以完成終延伸，將配置好的PCR反應體系放入PCR儀中進行擴增，并將PCR產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為100V電壓下運行30分鐘，記錄條帶的位置和清晰度，以評估產物的純度。
8.根據權利要求1所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述S400測序與數據分析選取測序深度、堿基質量分布均勻度、低質量堿基比例作為評估指標，通過計算不同位置的堿基質量對鑒定結果進行質量控制，即對原始測序數據進行預處理，包括去除接頭序列、過濾掉低質量的堿基，計算相鄰堿基間的相關性以及每個堿基的背景頻率，提高測序數據的質量評估精度，其公式為：P(e|i)是在位置i上發生錯誤的概率，F(bi)堿基b在位置i的背景頻率，δ是權重因子，用于調整相鄰位置堿基錯誤概率的影響程度，η是權重因子，用于調整相鄰位置堿基背景頻率的影響程度，Q(i)是位置i的新質量評分，通過考慮讀段長度和位置偏差因素，更準確地估計每個位置的錯誤概率，即P(e|i)＝αe-β|i-μ|+γ，α是影響錯誤概率的基礎值，β是控制位置偏差對錯誤概率的影響程度，γ代表背景錯誤率，μ讀段的中心位置，引入一個讀段長度的函數L(i)，讀段長度對錯誤率的影響，即Lmax是讀段的最大長度，通過考慮讀段長度對錯誤率的影響，準確估計錯誤率。
9.根據權利要求8所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述S400測序與數據分析通過考慮堿基的影響，準確地估計每個位置的背景頻率，即F(bi)＝F0(bi)×(1+ω1F1(bi-1)+ω2F2(bi+1))，F0(bi)為沒有影響的基本背景頻率，F1(bi-1)是前一個堿基的背景頻率，F2(bi+1)使后一個堿基的背景頻率，ω1和ω2調節影響強度的權重因子，將上述算法應用于測序數據上，計算每個讀段中每個堿基的新質量評分，比較同一讀段中不同位置的質量評分。
10.根據權利要求1所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述S500鑒定結果判斷的具體步驟為：
...【技術特征摘要】
1.一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，該鑒定方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述s100的具體步驟為：
3.根據權利要求2所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述s100rna提取與純化通過紫外分光光度計測定rna的a260/a280比值和a260/a230比值，以評估rna的純度，其中，對于a260/a280比值接近2.0，a260/a230比值接近2.0-2.2時，認為rna質量良好，將提取和純化后的rna儲存在-80℃條件下，以防止rna降解并為反轉錄和pcr擴增使用。
4.根據權利要求1所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述s200反轉錄與合成的具體步驟為：
5.根據權利要求4所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述s203反轉錄反應將純化后的rna樣品與特異性引物混合，并按照反轉錄試劑盒加入反轉錄酶，設置反轉錄反應條件為65℃，預熱為5分鐘以使rna變性，隨后置于冰上冷卻，進行反轉錄反應設置反應溫度和時間為42℃和1小時，并70℃加熱15分鐘以終止反應，通過s204使用紫外分光光度計測定cdna的濃度和純度，使cdna的a260/a280比值接近2.0，即cdna純度較高，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查cdna的質量，確保沒有降解現象。
6.根據權利要求1所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述s300pcr擴增與產物檢測的具體步驟為：
7.根據權利要求6所述一種基于分子標記的芝麻枯萎病鑒定方法，其特征在于，所述s303pcr擴增反應設置pcr擴增條件為94℃預變性5分鐘、94℃變性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分鐘、重復35個循環、以72℃延伸5分鐘以完成終延伸，將配置好的pcr反應體系放入pcr儀中進行擴增...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陰長發，段靈濤，陳洪凡，王希，鄧興，黃蓉，常曉珂，蘭波，楊迎青，
申請(專利權)人：江西省農業科學院植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：
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