【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于病毒反向遺傳，具體涉及在vero中拯救優化cva10病毒的質粒、方法和應用。
技術介紹
1、手足口病（hfmd）是一種全球范圍內的具有高度傳染性的病毒性疾病，主要影響嬰幼兒。cva10病毒是引起手足口病的主要病原體之一，目前，還沒有可以臨床應用的cva10病毒疫苗，開發針對cva10的新型減毒活疫苗，對hfmd的預防和控制有重大意義。
2、cva10病毒感染導致的手足口病通常表現為輕度和自限性癥狀，包括發熱、口腔潰瘍以及手足臀輕微水皰或小潰瘍，但是仍有少數病例會出現各種嚴重的臨床癥狀，如甲癬、皰疹性咽峽炎、高ck血癥、中樞神經系統并發癥，甚至死亡。先前的流行病學研究表明，幾十年來ev71和cva16一直是全球手足口病的主要病原體，但近年來，隨著ev71疫苗的上市，手足口病的流行譜發生了變化。但是ev71疫苗對其它腸道病毒血清型不具有交叉保護作用，導致cva10感染的增多。
3、目前，研究人員試圖采用不同的方法開發cva10?疫苗，這些疫苗都還處于實驗室研究階段，例如傳統的滅活病毒疫苗（甲醛滅活或β丙內酯滅活）、病毒樣顆粒（vlp）和亞單位疫苗。ev71、cva6和cva16疫苗毒株，一般要求疫苗株不能使用腫瘤細胞從臨床樣本中分離，但使用疫苗生產用細胞vero從臨床樣本中直接分離cva10非常困難。除了vero?細胞適應的?cva10/s0148b?菌株外，大部分cva10為rd分離株，不能很好地滿足疫苗開發的要求。除此之外，傳統的滅活cva10病毒疫苗，在生產過程中會出現較多的病毒空顆粒，病
技術實現思路
1、本專利技術提供了在vero中拯救優化cva10病毒的重組質粒、方法和應用，在vero細胞上成功拯救了優化的cva10病毒（co-cva10病毒），且拯救的co-cva10病毒與野生cva10病毒具有相似的生物學特性。
2、本專利技術提供了含cva10病毒基因組的重組質粒，所述重組質粒的骨架結構包括t7啟動子、優化的cva10病毒基因組、polya尾、線性化酶切位點bglⅱ和t7終止子。
3、優選的，所述重組質粒的骨架結構中，在t7啟動子和優化的cva10病毒基因組之間還包括順式錘頭核酶hhrib。
4、所述優化的cva10病毒基因組來源于cva10病毒候選疫苗株k6-19/xy/chn/2017（mt828547.1）經三代測序后得到的病毒最完整基因組，獲得mt828547.1中未包括的5'和3'utr序列。同時將mt828547.1的編碼序列（coding?sequences，cds）根據vero細胞的密碼子和表達特性進行了優化。組裝測序獲得的最完全5'和3'utr序列和優化后的cds序列，最后獲得全新的vero優化株適應株。
5、優選的，所述重組質粒的基本質粒骨架包括puc-gw-kan或pcdna3.1。
6、本專利技術還提供了上述重組質粒在vero細胞上拯救優化株co-cva10病毒的應用。
7、優選的，包括利用體外轉錄法或體內轉錄法，在所述vero細胞上拯救所述優化株co-cva10病毒。
8、本專利技術還提供了一種利用體外轉錄在vero細胞上拯救優化株cva10病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：利用上述重組質粒酶切線性化后進行體外轉錄獲得感染性rna，利用所述感染性rna轉染至vero細胞中進行病毒拯救，得拯救的優化株cva10病毒。
9、本專利技術還提供了利用上述體外轉錄方法拯救得到的優化株cva10病毒。
10、本專利技術還提供了一種利用體內轉錄在vero細胞上拯救優化株cva10病毒的方法，包括以下步驟：利用上述重組質粒與含t7?rna聚合酶的質粒共轉至vero細胞進行病毒拯救，得拯救的優化株cva10病毒。
11、本專利技術還提供了利用上述體內轉錄方法拯救得到的優化株cva10病毒。
12、本專利技術還提供了上述拯救得到的cva10病毒在制備優化株cva10疫苗中的應用。
13、有益效果：本專利技術通過三代測序獲得了cva10的完整基因組，經密碼子優化后利用反向遺傳學設計并合成了含co-cva10病毒基因組的質粒。
14、本專利技術所述質粒，可滿足vero細胞平臺進行病毒拯救的要求，即可通過：①體外轉錄方案，轉染病毒的感染性?rna至vero細胞拯救病毒；②體內轉錄方案，將含t7啟動子的病毒質粒和t7?rna聚合酶質粒共轉至vero細胞，讓病毒質粒在體內轉錄為病毒rna基因組，從而拯救病毒。
15、經本專利技術所述方法，從vero細胞中拯救得到的優化株優化株cva10病毒、優化病毒co-cva10與野生cva10病毒具有相似的生物學特性。因此，本專利技術可得到由vero細胞拯救的、活的cva10病毒，通過反向遺傳學技術，解決了cva10病毒不能在vero細胞上生產的困境，有望解決上述cva10疫苗開發中面臨的困難，從而預防手足口病，惠利于民。
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1.含CVA10病毒基因組的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒的骨架結構包括T7啟動子、經密碼子優化的CVA10病毒基因組、polyA尾，線性化酶切位點BglⅡ和T7終止子。
2.根據權利要求1所述重組質粒，其特征在于，所述經密碼子優化的CVA10病毒基因組包括以CVA10病毒候選疫苗株K6-19/XY/CHN/2017經三代測序后得到的病毒最完整基因組為模板，根據Vero細胞的密碼子和表達特性進行優化得到的基因組。
3.根據權利要求1或2所述重組質粒，其特征在于，所述重組質粒的基本質粒骨架包括pUC-GW-Kan或pcDNA3.1。
4.權利要求1~3任一項所述重組質粒在Vero細胞上拯救優化株CO-CVA10病毒的應用。
5.根據權利要求4所述應用，其特征在于，包括利用體外轉錄法或體內轉錄法，在所述Vero細胞上拯救所述優化株CO-CVA10病毒。
6.一種利用體外轉錄在Vero細胞上拯救優化株CO-CVA10病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：將權利要求1~3任一項所述重組質粒酶切線性化后進行體外轉錄獲得感染性R
7.利用權利要求6所述方法拯救得到的優化株CO-CVA10病毒。
8.一種利用體內轉錄在Vero細胞上拯救優化株CO-CVA10病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：將權利要求1~3任一項所述重組質粒與含T7?RNA聚合酶的質粒共轉至Vero細胞進行病毒拯救，得拯救的優化株CO-CVA10病毒。
9.利用權利要求8所述方法拯救得到的優化株CO-CVA10病毒。
10.權利要求7或權利要求9所述優化株CO-CVA10病毒在制備CO-CVA10疫苗中的應用。
...【技術特征摘要】
1.含cva10病毒基因組的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒的骨架結構包括t7啟動子、經密碼子優化的cva10病毒基因組、polya尾，線性化酶切位點bglⅱ和t7終止子。
2.根據權利要求1所述重組質粒，其特征在于，所述經密碼子優化的cva10病毒基因組包括以cva10病毒候選疫苗株k6-19/xy/chn/2017經三代測序后得到的病毒最完整基因組為模板，根據vero細胞的密碼子和表達特性進行優化得到的基因組。
3.根據權利要求1或2所述重組質粒，其特征在于，所述重組質粒的基本質粒骨架包括puc-gw-kan或pcdna3.1。
4.權利要求1~3任一項所述重組質粒在vero細胞上拯救優化株co-cva10病毒的應用。
5.根據權利要求4所述應用，其特征在于，包括利用體外轉錄法或體內轉錄法，在所述vero細胞上拯救所述優化株co-cv...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫浩，張小超，李禹霏，馬紹輝，李趙清，張瑤，
申請(專利權)人：中國醫學科學院醫學生物學研究所，
類型：發明
國別省市：
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