【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及生物合成，具體的，涉及一種l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法。
技術介紹
1、l-2-氨基己二酸作為一種非蛋白質(zhì)氨基酸，具有的廣泛用途，是合成β-內(nèi)酰胺類抗生素青霉素和頭孢菌素前體的重要手性砌塊，是廣譜合成藥物的中間體，可用于治療風濕病、銀屑病和前列腺癌等，同時還可作為合成某些特殊化學物質(zhì)的中間體，如甜味劑、多肽及螯合劑等，l-2-氨基己二酸在醫(yī)藥、化工、食品、飼料等領域市場潛力巨大，但現(xiàn)今l-2-氨基己二酸的供應不能滿足市場需求。而l-2-氨基己二酸-δ-半醛作為合成l-2-氨基己二酸的重要前體，其主要來源于化學合成，但此方法存在生產(chǎn)路線長、原料成本高、反應條件苛刻、收率不理想、污染環(huán)境等缺點。
2、利用生物催化或生物轉化法制備l-2-氨基己二酸具有條件溫和，成本較低，環(huán)境污染較少等優(yōu)勢，但起步較晚，沒有形成工業(yè)化生產(chǎn)的工藝。日本美露香公司篩選到產(chǎn)堿桿菌、假單胞菌、庫特氏菌可將底物l-六氫吡啶羧酸合成l-2-氨基己二酸。以賴氨酸為底物篩選到農(nóng)桿菌、產(chǎn)堿桿菌、短桿菌、芽孢桿菌可合成l-2-氨基己二酸。前者底物價格昂貴，后者反應效率極低，均不適宜工業(yè)化生產(chǎn)。kuniho?nakata等人篩選到一株黃桿菌，通過微生物培養(yǎng)可直接一步將賴氨酸上的氨基甲基轉化成羧基，且不用修飾α位置上的氨基，但轉化效率僅為25%。因此，本專利技術開發(fā)一種環(huán)保、高效的l-2-氨基己二酸-δ-半醛制備方法，以滿足l-2-氨基己二酸的合成及應用。
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術提出一種
2、本專利技術的技術方案如下：
3、本專利技術提出一種l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，包括以下步驟：
4、以l-賴氨酸和α-酮戊二酸為底物，經(jīng)轉氨酶和輔因子催化反應，得到l-2-氨基己二酸-δ-半醛；
5、所述轉氨酶為l-賴氨酸6-氨基轉移酶、l-賴氨酸6-氨基轉移酶的突變體中的一種；
6、所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶來源于韓國寡養(yǎng)單胞菌（ stenotrophomonas? koreensis），氨基酸序列如seq?id?no.2所示；
7、所述限定的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)。
8、作為進一步的技術方案，所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的突變體的氨基酸序列如seq?id?no.4、seq?id?no.6、seq?id?no.8、seq?id?no.10、seq?id?no.12、seq?id?no.14、seq?id?no.16、seq?id?no.18、seq?id?no.20、seq?id?no.22或seq?id?no.24所示，所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的突變體與所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶相比，存在如下突變中的至少一種：q71k、n76l、g212a、r213g。
9、作為進一步的技術方案，所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的編碼基因的序列為seq?idno.1或保有功能且編碼相同蛋白的定點誘變序列。
10、作為進一步的技術方案，所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的突變體的編碼基因序列為seqid?no.3、seqid?no.5、seqid?no.7、seqid?no.9、seqid?no.11、seqid?no.13、seqidno.15、seqid?no.17、seqid?no.19、seqid?no.21、seqid?no.23中任一種。
11、作為進一步的技術方案，所述轉氨酶的添加形式包括粗酶液或全細胞。
12、作為進一步的技術方案，所述粗酶液的制備方法，包括以下步驟：在宿主細胞中表達所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶，得到重組細胞；裂解所述重組細胞獲得所述粗酶液。
13、作為進一步的技術方案，所述全細胞的制備方法，包括以下步驟：在宿主細胞中表達所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶，得到的重組細胞為全細胞。
14、作為進一步的技術方案，所述重組細胞的制備方法，包括以下步驟：向所述宿主細胞導入能夠表達所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的核酸分子，經(jīng)誘導培養(yǎng)后獲得表達所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的所述重組細胞。
15、作為進一步的技術方案，所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的核酸分子通過重組載體導入到宿主細胞。
16、作為進一步的技術方案，所述宿主細胞為原核細胞。
17、作為進一步的技術方案，所述原核細胞為細菌。
18、作為進一步的技術方案，所述細菌為大腸桿菌，具體為e.coli?bl21?(de3)。
19、作為進一步的技術方案，所述重組載體為攜帶有所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的編碼基因的細菌質(zhì)粒。
20、作為進一步的技術方案，所述重組載體具體為將所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶或l-賴氨酸6-氨基轉移酶突變體的編碼基因替換pet-28a(+)載體的酶切位點bamh?ι和xho?i之間的小片段后得到的重組質(zhì)粒。
21、作為進一步的技術方案，當所述轉氨酶的添加形式為粗酶液時，所述轉氨酶在催化反應體系中的濃度為0.1~5g/l。
22、作為進一步的技術方案，當所述轉氨酶的添加形式為粗酶液時，所述轉氨酶在催化反應體系中的濃度為0.2g/l。
23、作為進一步的技術方案，當所述轉氨酶的添加形式為全細胞時，所述轉氨酶在催化反應體系中的濕重為10~50g/l。
24、作為進一步的技術方案，當所述轉氨酶的添加形式為全細胞時，所述轉氨酶在催化反應體系中的濕重為25g/l。
25、作為進一步的技術方案，所述催化反應在濃度為50~100mm，ph值為6.5~8.5的磷酸鹽緩沖液中進行。
26、作為進一步的技術方案，當所述轉氨酶的添加形式為粗酶液時，催化反應在濃度為50mm，ph值為7.0的磷酸鹽緩沖液中進行。
27、作為進一步的技術方案，當所述轉氨酶的添加形式為全細胞時，催化反應在濃度為50mm，ph值為7.0的磷酸鹽緩沖液中進行。
28、作為進一步的技術方案，所述催化反應的溫度為10~30℃，催化反應的時間為12~24h。
29、作為進一步的技術方案，所述催化反應的溫度為15℃，催化反應的時間為12h。
30、作為進一步的技術方案，所述催化反應還加入輔因子，所述輔因子為5-磷酸吡哆醛。
31、作為進一步的技術方案，當所述轉氨酶的添加形式為粗酶液或全細胞時，所述5-磷酸吡哆醛在催化反應體系中的濃度為0.1~1mm。
32、作為進一步的技術方案，當所述轉氨酶的添加形式為粗酶液或全細胞時，所述5-磷酸吡哆醛在催化反應體系中的濃度為0.4mm。
33、本專利技術的工作原理及有益效果為：
34、本專利技術中，利用生物本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.一種L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.?根據(jù)權利要求1所述的一種L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述L-賴氨酸6-氨基轉移酶的突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?No.4、SEQ?ID?No.6、SEQ?IDNo.8、SEQ?ID?No.10、SEQ?ID?No.12、SEQ?ID?No.14、SEQ?ID?No.16、SEQ?ID?No.18、SEQ?IDNo.20、SEQ?ID?No.22或SEQ?ID?No.24所示，所述L-賴氨酸6-氨基轉移酶的突變體與所述L-賴氨酸6-氨基轉移酶相比，存在如下突變中的至少一種：Q71K、N76L、G212A、R213G。
3.?根據(jù)權利要求1所述的一種L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述L-賴氨酸6-氨基轉移酶的編碼基因的序列為SEQ?ID?No.1或保有功能且編碼相同蛋白的定點誘變序列。
4.?根據(jù)權利要求1所述的一種L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述L-賴氨酸6-氨基轉移酶的突變體的編碼基因序列為
5.根據(jù)權利要求1所述的一種L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述轉氨酶的添加形式包括粗酶液或全細胞。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，當所述轉氨酶的添加形式為粗酶液時，所述轉氨酶在催化反應體系中的濃度為0.1~5g/L。
7.根據(jù)權利要求5所述的一種L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，當所述轉氨酶的添加形式為全細胞時，所述轉氨酶在催化反應體系中的濕重為10~50g/L。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述催化反應在濃度為50~100mM，pH值為6.5~8.5的磷酸鹽緩沖液中進行。
9.根據(jù)權利要求1所述的一種L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述催化反應的溫度為10~30℃，催化反應的時間為12~24h。
10.根據(jù)權利要求1所述的一種L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述催化反應還加入輔因子，所述輔因子為5-磷酸吡哆醛。
...【技術特征摘要】
1.一種l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.?根據(jù)權利要求1所述的一種l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的突變體的氨基酸序列如seq?id?no.4、seq?id?no.6、seq?idno.8、seq?id?no.10、seq?id?no.12、seq?id?no.14、seq?id?no.16、seq?id?no.18、seq?idno.20、seq?id?no.22或seq?id?no.24所示，所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的突變體與所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶相比，存在如下突變中的至少一種：q71k、n76l、g212a、r213g。
3.?根據(jù)權利要求1所述的一種l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的編碼基因的序列為seq?id?no.1或保有功能且編碼相同蛋白的定點誘變序列。
4.?根據(jù)權利要求1所述的一種l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述l-賴氨酸6-氨基轉移酶的突變體的編碼基因序列為seqid?no.3、seqid?no.5、seqid?no.7、seqid?no.9、seqid?no.11、seqid?...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：宋聰，賈振華，張翔，李冉，趙芊，劉昆昂，
申請(專利權)人：河北省科學院生物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。