【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物，具體涉及一種鏡像偶聯(lián)的蛋白質(zhì)納米顆粒綴合物及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、基于蛋白質(zhì)的病毒樣顆粒(vlp)疫苗比傳統(tǒng)的減毒活疫苗和滅活疫苗具有顯著優(yōu)勢。它們通常由一個中心顆粒支架、一個偶聯(lián)組分和各種抗原特異性元件組成，使它們能夠模擬真實(shí)病毒的結(jié)構(gòu)而不具有傳染性，使其對免疫功能低下的個體更安全。與單一抗原相比，人工組裝疫苗具有多個拷貝的抗原可以引發(fā)更強(qiáng)、更持久、可能更廣泛的免疫反應(yīng)。這種有效的免疫策略減少了頻繁接種加強(qiáng)針的需要，并提供了更強(qiáng)的病毒防護(hù)。
2、然而，對vlp組裝的穩(wěn)定性和完整性的擔(dān)憂一直存在，同時(shí)由于抗原蛋白固有的復(fù)雜性，使得模塊化疫苗組裝似乎比基因融合的方法在疫苗組裝上更加可靠。眾所周知，抗原蛋白通常需要在真核系統(tǒng)中表達(dá)以維持其活性。因此，抗原蛋白與vlp納米顆粒基本單元之間的基因融合會與蛋白質(zhì)折疊和翻譯后修飾這些要求相沖突，對稱失配的問題會因此加劇，并使得蛋白質(zhì)納米顆粒與真核抗原蛋白的組裝變得相當(dāng)復(fù)雜。這就需要開發(fā)出vlp和抗原蛋白之間的有效偶聯(lián)策略，以實(shí)現(xiàn)最佳的疫苗組裝，同時(shí)縮短制造時(shí)間。在過去的幾十年里，點(diǎn)擊化學(xué)在vlp抗原蛋白組裝方面展現(xiàn)出了巨大的前景，一些非共價(jià)和共價(jià)的方法被不斷開發(fā)出來。共價(jià)修飾為vlp疫苗顆粒提供了更大的穩(wěn)定性，使其不易受到環(huán)境變化的影響。在這些方法中，諜化學(xué)(spy?chemistry)因其高效穩(wěn)定的過程而脫穎而出，即使在惡劣條件下也能形成基因可編碼和自發(fā)的異肽鍵。目前spytag/spycatcher及其衍生物已被廣泛應(yīng)用于vlp疫苗開發(fā)。
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4、然而，由于spycatcher和spytag的分子量較大，spy?chemistry留下的分子疤痕可能很嚴(yán)重，形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物的分子量約為14kda。由于空間效應(yīng)，這可能會阻礙vlp的進(jìn)一步組裝和抗原錨定。此外，spytag和spycatcher之間的反應(yīng)在接觸后立即發(fā)生，這使得該反應(yīng)過程不太可控。從設(shè)計(jì)角度來看，疫苗vlp顆粒組裝中涉及的偶聯(lián)片段可能會無意中引發(fā)自身免疫，這是不希望發(fā)生的。另外，由于spycatcher來源于致病細(xì)菌化膿性鏈球菌的膜蛋白，因此存在誘導(dǎo)不必要的免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，這可能會限制其未來的臨床應(yīng)用。
5、蛋白質(zhì)連接酶spystapler可介導(dǎo)vlp疫苗的組裝。spystapler從spycatcher中分離出來，剩下的片段名為bdtag。bdtag和spytag之間在spystapler的催化下仍然可以形成異肽鍵。由于spystapler和其他兩個肽片段之間相互作用的非共價(jià)性質(zhì)，spystapler的作用類似于連接酶，一旦反應(yīng)完成，就可以被去除。
6、然而，bdtag和spytag的連接效率亟待進(jìn)一步提高，這種方式組裝的vlp疫苗并不穩(wěn)定，還存在疫苗連接組分容易產(chǎn)生不必要的免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決上述至少一個問題，本公開提供了一種綴合物和應(yīng)用，所述綴合物更容易逃避蛋白酶的識別，能夠顯著延長在生物系統(tǒng)重的半衰期，且不易引發(fā)不必要的免疫反應(yīng)，具有良好的生物穩(wěn)定性和安全性。
2、根據(jù)本公開的一個方面，提供了一種綴合物，其中所述綴合物包含：i)第一肽標(biāo)簽標(biāo)記的功能蛋白，和ii)第二肽標(biāo)簽標(biāo)記的支架蛋白，其中，所述第一肽標(biāo)簽和所述第二肽標(biāo)簽由d-氨基酸殘基構(gòu)成；所述第一肽標(biāo)簽和所述第二肽標(biāo)簽形成肽伴侶對，所述第一肽標(biāo)簽和所述第二肽標(biāo)簽之間通過異肽鍵偶聯(lián)結(jié)合。
3、在一些實(shí)施方式中，所述第一肽標(biāo)簽與所述功能蛋白之間和/或所述支架蛋白與第二肽標(biāo)簽之間含有如lpxt(g)w所示的氨基酸序列。
4、在一些實(shí)施方式中，所述第一肽標(biāo)簽標(biāo)記的功能蛋白自n端至c端包括功能蛋白、lpxt(g)w和第一肽標(biāo)簽，或者包括第一肽標(biāo)簽、lpxt(g)w和功能蛋白，任選地，在所述功能蛋白和lpxt(g)w之間具有接頭序列。
5、在一些實(shí)施方式中，所述第二肽標(biāo)簽標(biāo)記的支架蛋白自n端至c端包括支架蛋白、lpxt(g)w和第二肽標(biāo)簽，或者包括第二肽標(biāo)簽、lpxt(g)w和支架蛋白，任選地，在所述支架蛋白和lpxt(g)w之間具有接頭序列。
6、在一些實(shí)施方式中，其中x為任意l-氨基酸，w為1至20的任意整數(shù)。
7、在一些實(shí)施方式中，所述x為a、i、l、v、f、w、y、n、c、q、m、s、t、r、h、k、d、e、p或g。
8、在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述x為e。
9、在一些實(shí)施方式中，所述w＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
10、在一些實(shí)施方式中，所述接頭序列選自柔性接頭、剛性螺旋接頭、柔性卷曲接頭和/或β鏈接頭，優(yōu)選柔性卷曲接頭。
11、在一些實(shí)施方式中，所述柔性接頭選自(gvs)h或(g)h。
12、在一些實(shí)施方式中，所述柔性接頭包括如ggs或ggsggs(seq?id?no：21)所示的氨基酸序列，或與其具有至少65％序列同一性的氨基酸序列。
13、在一些實(shí)施方式中，所述剛性螺旋接頭選自eavk、a(eavk)ha。
14、在一些實(shí)施方式中，所述剛性螺旋接頭包括eaaak(seq?id?no：22)所示的氨基酸序列，或與其具有至少65％序列同一性的氨基酸序列。
15、在一些實(shí)施方式中，所述柔性卷曲接頭包括rvnpvelg(seq?id?no：23)所示的氨基酸序列，或與其具有至少65％序列同一性且具有接頭功能的氨基酸序列。
16、在一些實(shí)施方式中，所述β鏈接頭包括vsvatnwg(seq?id?no：24)所示的氨基酸序列，或與其具有至少65％序列同一性的氨基酸序列。
17、在一些實(shí)施方式中，所述v為1至10的任意整數(shù)。
18、在一些實(shí)施方式中，所述v＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
19、在一些實(shí)施方式中，所述h為1至30的任意整數(shù)。
20、在一些實(shí)施方式中，所述h＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
21、在一些實(shí)施方式中，所述第一肽標(biāo)簽和所述第二肽標(biāo)簽選自以下一種或多種肽伴侶對：構(gòu)成spytag和bdtag對、spytag和spycatcher對、snoopt本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種綴合物，其中所述綴合物包含：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述綴合物，其特征在于，所述第一肽標(biāo)簽與所述功能蛋白之間和/或所述支架蛋白與第二肽標(biāo)簽之間含有如LPXT(G)w所示的氨基酸序列，其中X為任意L-氨基酸，w為1至20的任意整數(shù)；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其特征在于，所述第一肽標(biāo)簽和所述第二肽標(biāo)簽選自以下一種或多種肽伴侶對：SpyTag和BDTag對、SpyTag和SpyCatcher對、SnoopTag和SnoopCatcher對、SnoopTagJr和SnoopCatcher對、SnoopTag和DogTag對、SnoopTagJr和DogTag對、DogTag和DogCatcher對、Pilin-C和Isopeptag對、Isopeptag-N和Pilin-N對、SdyCatcher和SdyTag對、PsCsCatcher和PsCsTag對、Jo和In對、RrgATag和RrgACatcher對、DogTag和RrgACatcher對、kTAG和SpyTAG對，RumTrunkTag和Mooncake對、RumTrunkTag和Katl對，
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述綴合物，其特征在于，所述功能蛋白包括抗原、抗體或抗原結(jié)合片段、治療肽、可檢測標(biāo)簽、細(xì)胞穿透肽、靶向肽或膜融合肽中的一種或多種；
5.根據(jù)權(quán)利要求1任一項(xiàng)所述綴合物，其特征在于，所述支架蛋白由L-氨基酸殘基構(gòu)成；
6.一種納米顆粒，所述納米顆粒包括權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的綴合物，
7.一種肽標(biāo)簽標(biāo)記的蛋白，所述肽標(biāo)簽由D-氨基酸殘基構(gòu)成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述肽標(biāo)簽標(biāo)記的蛋白，其特征在于，所述肽標(biāo)簽與所述蛋白之間含有如LPXT(G)w所示的氨基酸序列，其中X為任意L-氨基酸，w為1至20的任意整數(shù)；
9.一種制備權(quán)利要求7或8所述肽標(biāo)簽標(biāo)記的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)肽酶包括sortase；
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述方法，其特征在于，所述肽標(biāo)簽通過化學(xué)合成，和/或所述蛋白由基因編碼或通過化學(xué)合成。
12.一種藥物組合物，其包括：權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述綴合物或者權(quán)利要求6所述納米顆粒；以及，藥學(xué)上可接受的輔料。
13.權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述綴合物、權(quán)利要求6所述納米顆粒或權(quán)利要求12所述藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療疾病的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述藥物包括疫苗；更優(yōu)選地，所述藥物組合物包括納米顆粒疫苗。
14.權(quán)利要求6所述納米顆粒作為遞送載體遞送藥物的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述藥物被包封于所述納米顆粒中。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種綴合物，其中所述綴合物包含：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述綴合物，其特征在于，所述第一肽標(biāo)簽與所述功能蛋白之間和/或所述支架蛋白與第二肽標(biāo)簽之間含有如lpxt(g)w所示的氨基酸序列，其中x為任意l-氨基酸，w為1至20的任意整數(shù)；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其特征在于，所述第一肽標(biāo)簽和所述第二肽標(biāo)簽選自以下一種或多種肽伴侶對：spytag和bdtag對、spytag和spycatcher對、snooptag和snoopcatcher對、snooptagjr和snoopcatcher對、snooptag和dogtag對、snooptagjr和dogtag對、dogtag和dogcatcher對、pilin-c和isopeptag對、isopeptag-n和pilin-n對、sdycatcher和sdytag對、pscscatcher和pscstag對、jo和in對、rrgatag和rrgacatcher對、dogtag和rrgacatcher對、ktag和spytag對，rumtrunktag和mooncake對、rumtrunktag和katl對，或其變體或片段的組合，優(yōu)選選自spytag和bdtag對或其變體或片段，
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述綴合物，其特征在于，所述功能蛋白包括抗原、抗體或抗原結(jié)合片段、治療肽、可檢測標(biāo)簽、細(xì)胞穿透肽、靶向肽或膜融合...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫飛，寇松姿，
申請(專利權(quán))人：深圳灣實(shí)驗(yàn)室，
類型：發(fā)明
國別省市：
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