【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，屬于單顆粒成像和數字免疫分析。
技術介紹
1、數字免疫分析是通過計數單個目標蛋白產生的免疫復合物進行定量的蛋白質分析方法，在疾病早期篩查和預后檢測等方面顯示出巨大的應用前景。熒光成像是數字免疫分析常用的檢測手段，一般以熒光納米顆粒（比如量子點、上轉換納米粒子）作為免疫復合物的標記信號，將免疫復合物的技術轉化為納米顆粒的計數，采用電荷吸引等手段將納米顆粒或二聚體轉移至基板表面，高倍物鏡結合成像元件對納米顆粒或二聚體進行單顆粒水平的熒光成像，依據熒光照片進行計數和蛋白定量。由于單個納米顆粒的熒光強度低，需要使用高數值孔徑（≥0.6）和高放大倍數（≥60倍）的油鏡才能收集到足夠多的熒光，實現單個納米顆粒的熒光成像。高放大倍數的油鏡存在如下問題：（1）視場小，限制單次成像的檢測通量；（2）鏡油使用不方便，不適合自動對焦和自動掃描成像。因此，使用低倍數的非油物鏡（≤40倍）成為自動化、高通量成像檢測迫切需求。然而，低倍物鏡對熒光的收集能力較弱，對于量子點、上轉換粒子等尺寸極小的納米顆粒進行單顆粒成像存在挑戰(zhàn)。盡管目前已發(fā)展了部分熒光增強技術，比如微球透鏡增強、光子晶體結構增強、貴金屬增強等，但是存在納米顆粒遺漏（微球透鏡增強和光子晶體結構增強）、納米顆粒與貴金屬層的距離難控制（貴金屬增強）、與數字免疫分析流程不兼容等問題。因此，發(fā)展適用于低倍數物鏡單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法對數字免疫分析的自動化和商業(yè)化具有重要意義。
技術實現思路b>
1、本專利技術所要解決的技術問題是，克服現有技術的不足而提供一種用于低倍數物鏡單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，以解決單顆粒熒光成像需使用高倍油鏡所產生的問題，同時也解決了低倍鏡應用在數字免疫分析領域所存在的納米顆粒遺漏、納米顆粒與貴金屬層的距離難控制、與數字免疫分析流程不兼容等問題。
2、本專利技術提供一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，包括以下步驟：
3、步驟1、金屬基底制作—采用鍍膜技術在玻璃或硅片表面加工一層金屬薄膜，形成金屬基底；
4、步驟2、基片表面納米粒子固定—將納米粒子的水溶液與水溶性聚合物混合，形成混合溶液，取混合溶液滴加于基片表面，蒸發(fā)水分；
5、步驟3、金屬基底與基片組成—將金屬基底與固定納米粒子的基片對接，通過水溶性聚合物的濃度控制金屬基底與納米粒子的間距，之后采用膠帶進行封接，獲得納米粒子樣品；
6、步驟4、熒光成像—將制備好的納米粒子樣品置于顯微鏡載物臺，低倍數物鏡結合成像元件進行單個納米粒子的熒光成像。
7、本專利技術提供一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，包含金屬基底制作、基片表面納米粒子固定、金屬基底與基片可控組裝，熒光成像等過程；載玻片或硅片表面采用鍍膜技術鍍上金屬薄層，形成金屬基底；納米粒子水溶液與水溶性聚合物按一定比例混合均勻，形成混合溶液，取一定體積的混合溶液滴加于基片表面，蒸發(fā)水分，聚合物在基片表面析出，在基片表面形成邊緣環(huán)狀的薄膜，納米粒子分散固定于薄膜中；金屬基底與固定納米粒子的基片對接，控制金屬基底與納米粒子的間距，膠帶封接。封裝好的金屬基底與基片放置于顯微鏡載物臺，低倍物鏡結合成像元件即可實現單個納米粒子的熒光成像。
8、作為本專利技術進一步優(yōu)化的技術方案如下：
9、所述步驟1中，鍍膜技術為熱蒸發(fā)鍍膜、磁控濺射、化學氣相沉積技術的一種，所述金屬薄膜的材質為金、銀、鉻、鎳、鈦、鉑中的至少一種。
10、優(yōu)選地，所述金屬薄膜為單層結構或多層結構。
11、所述步驟2中，所述納米粒子為尺寸在500nm以下的熒光材料，包括量子點、碳點、金簇、銀簇、上轉換粒子、熒光聚苯乙烯球、熒光二氧化硅球中的至少一種，所述水溶性聚合物為聚乙烯醇、葡聚糖、聚丙烯酸、羥丙基甲基纖維素、明膠、海藻酸、蔗糖中的至少一種，所述基片的材質為玻璃、硅片、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚4－甲基－1－戊烯、聚砜中的一種。
12、優(yōu)選地，所述混合溶液中納米粒子的濃度為0.1am～1mm，水溶性聚合物的質量百分比濃度為0.005%～1%。
13、所述步驟3中，金屬基底與納米粒子之間的間距采用水溶性聚合物的濃度進行控制，不同濃度的水溶性聚合物形成的環(huán)狀薄膜邊緣厚度不同，環(huán)狀邊緣的厚度直接決定薄膜中納米粒子與金屬基底的距離。
14、優(yōu)選地，所述納米粒子與金屬基底的間距為5nm～200nm。
15、所述步驟4中，所述低倍數物鏡為放大倍數在60倍以下的以空氣為介質的干鏡，所述成像元件為cmos、ccd中的一種。
16、與現有技術相比，本專利技術采用低倍數物鏡實現了對單個納米粒子的熒光成像，低倍物鏡的視場大，有效增加了單次成像的檢測通量；該方法不涉及任何昂貴和復雜儀器，操作簡單，適用范圍廣，有望解決單顆粒熒光成像的自動掃描、對焦、成像和計數的難題，有利于數字免疫分析的技術轉化。
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1.一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，其特征在于，所述步驟1中，鍍膜技術為熱蒸發(fā)鍍膜、磁控濺射、化學氣相沉積技術的一種，所述金屬薄膜的材質為金、銀、鉻、鎳、鈦、鉑中的至少一種。
3.根據權利要求2所述一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，其特征在于，所述金屬薄膜為單層結構或多層結構。
4.根據權利要求1所述一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，其特征在于，所述步驟2中，所述納米粒子為尺寸在500nm以下的熒光材料，包括量子點、碳點、金簇、銀簇、上轉換粒子、熒光聚苯乙烯球、熒光二氧化硅球中的至少一種，所述水溶性聚合物為聚乙烯醇、葡聚糖、聚丙烯酸、羥丙基甲基纖維素、明膠、海藻酸、蔗糖中的至少一種，所述基片的材質為玻璃、硅片、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚4－甲基－1－戊烯、聚砜中的一種。
5.根據權利要求4所述一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像
6.根據權利要求1所述一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，其特征在于，所述步驟3中，金屬基底與納米粒子之間的間距采用水溶性聚合物的濃度進行控制，不同濃度的水溶性聚合物形成的環(huán)狀薄膜邊緣厚度不同，環(huán)狀邊緣的厚度直接決定薄膜中納米粒子與金屬基底的距離。
7.根據權利要求6所述一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，其特征在于，所述納米粒子與金屬基底的間距為5nm～200nm。
8.根據權利要求1所述一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，其特征在于，所述步驟4中，所述低倍數物鏡為放大倍數在60倍以下的以空氣為介質的干鏡，，所述成像元件為CMOS、CCD中的一種。
...【技術特征摘要】
1.一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，其特征在于，所述步驟1中，鍍膜技術為熱蒸發(fā)鍍膜、磁控濺射、化學氣相沉積技術的一種，所述金屬薄膜的材質為金、銀、鉻、鎳、鈦、鉑中的至少一種。
3.根據權利要求2所述一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，其特征在于，所述金屬薄膜為單層結構或多層結構。
4.根據權利要求1所述一種用于低倍數物鏡下單個納米粒子熒光成像的樣品制備方法，其特征在于，所述步驟2中，所述納米粒子為尺寸在500nm以下的熒光材料，包括量子點、碳點、金簇、銀簇、上轉換粒子、熒光聚苯乙烯球、熒光二氧化硅球中的至少一種，所述水溶性聚合物為聚乙烯醇、葡聚糖、聚丙烯酸、羥丙基甲基纖維素、明膠、海藻酸、蔗糖中的至少一種，所述基片的材質為玻璃、硅片、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚4－...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：蓋宏偉，王雅夢，張清泉，
申請(專利權)人：江蘇師范大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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