【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體涉及一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法。
技術介紹
1、產氣莢膜梭菌噬菌體治療產氣莢膜梭菌感染引起的疾病被公眾廣泛認可，該方法起效快，無抗生素殘留，不會引起細菌耐藥性。由于產氣莢膜梭菌為厭氧菌，因此在培養的過程中會進行無氧呼吸利用葡萄糖產酸使發酵液ph降低，較低的ph值將影響發酵液噬菌體效價，并且對噬菌體的穩定性產生很大的影響。目前，產氣莢膜梭菌噬菌體的制備多采用成品的培養基例如腦心浸出液培養基、tsb培養基、強化梭菌培養基、厭氧肉肝湯培養基等，這些培養基雖然發酵液效價相對穩定，但是工業化生產時成本較高。針對上述中的相關技術，專利技術人發現，為了解決發酵液效價低和不穩定的問題，具體的解決方案有：篩選高效價的噬菌體，此種方法雖然簡單，但是對于部分性能優良但效價低的噬菌體不友好；培養基及發酵工藝進行優化，例如，cn117431219a中針對噬菌體rdp-cp-21008中的培養基及發酵工藝，但技術方案仍存在發酵液ph值偏低的問題，導致最終發酵液噬菌體效價低且不穩定的問題；cn117925441a專利中的培養基成分復雜，存在生產成本較高的問題。這些問題的存在不利于產氣莢膜梭菌噬菌體的工業化生產，最終導致在養殖業中大規模的應用受到了阻礙。
技術實現思路
1、本專利技術旨在針對現有技術的不足，提供一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法。本專利技術的目的在于，提供了一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，該方法使得生產的噬菌體長期維持效價穩定，該方法通過改善生產過程中ph
2、為解決上述問題，本專利技術提供了如下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供了一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，包括以下步驟：
4、s1.種子活化：將宿主產氣莢膜梭菌種子和產氣莢膜梭菌噬菌體種子進行活化，分別獲得種子活化后的宿主菌菌液和噬菌體增殖液；所述步驟s1使用試管活化菌種，為一級種子；
5、s2.種子擴增：將步驟s1所述的宿主菌菌液和噬菌體增殖液進行種子擴增，分別獲得種子擴增后的宿主菌菌液和噬菌體增殖液；所述步驟s2屬于放大擴增，擴增到適合發酵罐生產的接種量，具體為逐級擴大培養，每級擴大10至100倍體積，放大二至三級才能達到發酵罐的接種量；
6、s3.發酵罐擴大生產：將步驟s2制備的宿主菌菌液接種到發酵培養基中，溫度為40-45℃，轉速為10-30rpm，罐壓為0.5-1.0mpa，厭氧培養0-3h，然后再接種步驟s2制備的噬菌體增殖液，溫度為35-40℃，轉速為40-60rpm，罐壓為0.5-1.0mpa，厭氧條件培養0.5-2h，緊接著將溫度提高到40-45℃，轉速為10-20rpm，罐壓維持0.5-1.0mpa，厭氧培養4-6h結束發酵，在線調控ph。
7、如上所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，所述步驟s3中的發酵培養基為工業化發酵培養基、tsb肉湯、厭氧肉肝湯、ftg肉湯中的任意一種。
8、優選的，所述步驟s3中的發酵培養基為工業化發酵培養基，所述工業化生產發酵培養基，包括以下成分：以質量百分比計，1-2％厭氧肉肝湯、1-5％酵母浸粉、0.2-1.5％蛋白胨、1-3％碳源、0.5-0.9％氯化鈉、0.002-0.01％氯化鎂、0.002-0.01％氯化鈣、0.001-0.01％碳酸鈣，初始ph為8.0-8.5。如上所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，所述工業化生產發酵培養基中的碳源為葡萄糖、蔗糖或者可溶性淀粉中的任意一種。優選的，所述工業化生產發酵培養基中的碳源為蔗糖。
9、如上所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，所述步驟s3中的發酵培養基的初始ph為6.0-10.0。優選的，所述步驟s3中的發酵培養基的初始ph為8.0。
10、如上所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，所述步驟s3中的在線調控ph具體包括以下步驟：在接種步驟s2制備的噬菌體增殖液后的培養的過程中時刻監測ph變化情況，當ph降到7.0時就及時補加ph發酵調節劑調節ph，每次補加10ml，5min后檢測ph是否達到7.5，若達到則停止補加，未達到繼續補加，將整個發酵過程中ph值維持在6.5-7.5。優選的，將整個發酵過程中ph值維持在6.8-7.4。優選的，所述ph發酵調節劑為1mol/l氫氧化鈉溶液。優選的，當ph降到7時開始補加ph發酵調節劑氫氧化鈉溶液最終發酵液效價較高。
11、如上所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，所述步驟s3中，所述的宿主菌菌液和噬菌體增殖液的最佳接種時間間隔為0.5-2h。優選，所述步驟s3中，所述的宿主菌菌液和噬菌體增殖液的最佳接種時間間隔為0.5h。
12、如上所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，所述產氣莢膜梭菌噬菌體選自產氣莢膜梭菌噬菌體rdp-cp-22001、產氣莢膜梭菌噬菌體rdp-cp-21008、產氣莢膜梭菌噬菌體rdpcp23006、產氣莢膜梭菌噬菌體rdpcp23040中的任意一種；其中，所述產氣莢膜梭菌噬菌體rdp-cp-22001于2023年03月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.45448；所述產氣莢膜梭菌噬菌體rdp-cp-21008于2022年4月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.45091；所述產氣莢膜梭菌噬菌體rdpcp23006于2023年06月12日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.45573；產氣莢膜梭菌噬菌體rdpcp23040于2023年06月12日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.45583。
13、第二方面，基于同一個專利技術構思，本專利技術提供了一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法得到的噬菌體發酵產品。該噬菌體產品在4℃條件下保存35天，效價基本保持在同一個數量級，該噬菌體產品在37℃條件下下保存35天，效價下降不到兩個數量級，由此可見，本專利技術的在線調控ph的生產工藝不僅提高了噬菌體發酵液的生產效價，而且，提高了噬菌體的穩定性，產生了預料不到的技術效果。
14、如上所述的噬菌體發酵產品，其特征在于，所述噬菌體發酵產品的效價≥107pfu/ml。
15、與現有的技術相比，本專利技術效果和優點是：
16、1、本專利技術提供的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，選擇采用工業化發酵培養基，效價都穩定在107pfu/ml以上，且本培養基相比較其他幾種培養基成本更低，更加適合工業化生產使用。
17、2、本專利技術提供的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，最終的宿主菌和噬菌體的最佳接種本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述步驟S3中的發酵培養基為工業化發酵培養基、TSB肉湯、厭氧肉肝湯、FTG肉湯中的任意一種。
3.根據權利要求2所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述步驟S3中的發酵培養基為工業化發酵培養基，所述工業化生產發酵培養基，包括以下成分：以質量百分比計，1-2％厭氧肉肝湯、1-5％酵母浸粉、0.2-1.5％蛋白胨、1-3％碳源、0.5-0.9％氯化鈉、0.002-0.01％氯化鎂、0.002-0.01％氯化鈣、0.001-0.01％碳酸鈣，初始pH為8.0-8.5。
4.根據權利要求3所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述工業化生產發酵培養基中的碳源為葡萄糖、蔗糖或者可溶性淀粉中的任意一種。
5.根據權利要求2所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述步驟S3中的發酵培養基的初始pH為6.0-10.0。
6.根據權利要求3
7.根據權利要求3所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述步驟S3中，所述的宿主菌菌液和噬菌體增殖液的最佳接種時間間隔為0.5-2h。
8.根據權利要求1所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述產氣莢膜梭菌噬菌體選自產氣莢膜梭菌噬菌體RDP-CP-22001、產氣莢膜梭菌噬菌體RDP-CP-21008、產氣莢膜梭菌噬菌體RDPCP23006、產氣莢膜梭菌噬菌體RDPCP23040中的任意一種；其中，所述產氣莢膜梭菌噬菌體RDP-CP-22001于2023年03月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?NO.45448；所述產氣莢膜梭菌噬菌體RDP-CP-21008于2022年4月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.45091；所述產氣莢膜梭菌噬菌體RDPCP23006于2023年06月12日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?NO.45573；產氣莢膜梭菌噬菌體RDPCP23040于2023年06月12日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.45583。
9.根據權利要求1～8任意一項所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法得到的噬菌體發酵產品。
10.根據權利要求9所述的噬菌體發酵產品，其特征在于，所述噬菌體發酵產品的效價≥107pfu/mL。
...【技術特征摘要】
1.一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述步驟s3中的發酵培養基為工業化發酵培養基、tsb肉湯、厭氧肉肝湯、ftg肉湯中的任意一種。
3.根據權利要求2所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述步驟s3中的發酵培養基為工業化發酵培養基，所述工業化生產發酵培養基，包括以下成分：以質量百分比計，1-2％厭氧肉肝湯、1-5％酵母浸粉、0.2-1.5％蛋白胨、1-3％碳源、0.5-0.9％氯化鈉、0.002-0.01％氯化鎂、0.002-0.01％氯化鈣、0.001-0.01％碳酸鈣，初始ph為8.0-8.5。
4.根據權利要求3所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述工業化生產發酵培養基中的碳源為葡萄糖、蔗糖或者可溶性淀粉中的任意一種。
5.根據權利要求2所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述步驟s3中的發酵培養基的初始ph為6.0-10.0。
6.根據權利要求3所述的一種提升產氣莢膜梭菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述步驟s3中的在線調控ph具體包括以下步驟：在接種步驟s2制備的噬菌體增殖液后的培養的過程中時刻監測ph變化情況，當ph降低到7.0以下時及時補加ph發酵調節劑調節ph，將整個發酵過程中ph值維持在6.5-7.5。
7.根據權...
【專利技術屬性】
技術研發人員：杜新永，劉長太，馬如霞，白靜，侯連娜，
申請(專利權)人：青島潤達生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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