【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物制品領域，尤其涉及海參卵源肽復合物的制備方法及其應用。
技術介紹
1、基于衰老自由基學說，外源抗氧化物質的攝入已成為目前抗衰老的重要途徑之一，而針對于皮膚衰老，黑色素的積累也是其重要的表現。黑色素是廣泛存在于皮膚中的一種吲哚多聚物，當肌膚受到紫外線輻射時，機體的黑色素細胞會產生黑色素并在黑素小體中積累起到保護皮膚的作用。但過量的黑色素沉積會導致一系列如黃褐斑、雀斑、黑素病、脂溢性角化病等皮膚問題，已經成為困擾愛美人士的主要問題。酪氨酸酶是控制細胞黑色素生成的限速酶，可以通過氧化還原反應催化黑色素生成。其活性高低直接影響黑色素的生成量，尋找具有酪氨酸酶抑制活性的物質是降低機體黑色素的關鍵。此外，已有大量研究證實黑色素的產生與機體的氧化應激存在相互影響。具體而言，黑色素生成的過程會產生大量的活性氧自由基，而過量的自由基也會進一步損傷黑色素細胞，促進色素積累，增加衰老程度，因此，減少機體氧化應激，降低酪氨酸酶活性，對減少色素沉積，避免皮膚衰老具有重要作用。但目前對皮膚抗衰老的研究大多僅關注于抗氧化，缺乏對其酪氨酸酶抑制活性的評估，尋找、制備具有抗氧化及酪氨酸酶抑制雙活性的物質具有重要意義。
2、生物活性肽因其高效、高穩定性等特點越來越受到關注，傳統的生物活性肽制備主要通過酶解技術獲得肽混合液且以單一酶解技術為主。在實際實驗中，專利技術人發現單一酶制劑制備生物活性肽存在酶解死角、耗時長、作用不均、穩定性低、重現性差等弊病。混合液中復雜的肽組分及無/低生物活性肽的存在可能會影響其活性效率。在混合液的基礎上，通
3、海參卵是海參加工副產物，含有大量蛋白質等營養組分。隨著消費者對海參需求量的增大，海參卵的數量急劇擴增，通常被當作廢料丟棄，造成巨大的蛋白資源浪費。海參卵蛋白質精深加工率低主要與其氨基酸組成有關，海參卵中蛋白質以膠原蛋白為主，由甘氨酸、精氨酸及其他堿性氨基酸組成。單一酶解法制備生物活性肽主要是通過酶切蛋白質外層氨基酸，外層氨基酸鏈瓦解后繼而進行蛋白內部酶解，酶解時間較長、效率低、生物活性低。
4、因此，提供一種操作簡便、高效、快速實現雙功效海參卵源肽的制備方法迫在眉睫。目前，未有報道將堿性蛋白酶-胰蛋白酶復合使用于海參卵，以制備具有抗氧化、酪氨酸酶抑制及可以降低黑色素含量的活性肽。
技術實現思路
1、針對現有海參卵利用率低且活性單一的現象，本專利技術提供一種復合酶處理的海參雙活性(抗氧化和酪氨酸抑制)海參卵源肽復合物的制備方法及應用。在此基礎上，本專利技術以海參卵源肽復合物為原料，通過傳統分離純化技術結合計算機輔助技術，實現可以降低黑色素含量及具有抗氧化及酪氨酸酶抑制雙活性生物活性肽的制備。
2、本專利技術解決上述技術問題的技術方案如下：
3、本專利技術提供一種復合酶處理的海參雙功效海參卵源肽復合物的制備方法，包括以下步驟：將海參卵粉使用堿性蛋白酶-胰蛋白酶同步酶解。
4、采用上述技術方案的有益效果包括：
5、海參加工工業副產物綠色化加工程度低是目前限制產業發展的瓶頸，大量海參卵的廢棄造成了巨大的經濟和資源浪費，本專利技術制備得到了具有抗氧化和酪氨酸酶抑制活性的海參卵雙功能肽復合物，可以促進海參產業鏈的延長，實現海參工業副產物精深加工程度的提升。本專利技術海參卵源復合肽制備方法具有高效、重現性好、可以降低黑色素含量、抗氧化效果好、酪氨酸酶抑制活性高、肽分子量小等特點。
6、在制備過程中，本專利技術使用堿性蛋白酶和胰蛋白酶同步酶解，利用胰蛋白酶專一性切割羧基側為堿性氨基酸的肽鍵，進一步暴漏內部疏水氨基酸、芳香族氨基酸酶切位點。同時完成堿性蛋白酶其精準識別、切割，實現海參蛋白質的“層層”酶切，增加復合物中以疏水性氨基酸、芳香族氨基酸為末端的小分子肽數量，提高抗氧化及酪氨酸酶抑制活性，實現雙功能活性肽復合物的制備。
7、進一步，所述海參卵粉為脫脂海參卵粉。
8、進一步，還包括將酶解后的產物超濾的步驟：將酶解產物依次經過分子量為10kda和3kda的超濾膜，收集分子量大于10kda的組分、3kda-10kda的組分和小于3kda的組分。
9、進一步，還包括將小于3kda的組分采用葡聚糖凝膠樹脂sephadexg-15分離的步驟，第25管至第50管合并到一起作為scp-1組分、第58管至第77管合并到一起作為scp-2組分，第85管至103管合并到一起作為scp-3組分。
10、進一步，還包括將scp-2組分進行高效液相色譜分離，收集保留時間分別為2.099min、3.148min、4.833min、5.352min、13.533min、14.992min、20.99min的組分，分別依次命名為scp-2-1至scp-2-7。
11、進一步，酶解條件包括：將海參產卵粉的水溶液，調節ph＝7.5，加入混合酶，混合酶酶活與底物質量比為2000u/g，混合酶中，堿性蛋白酶與胰蛋白酶的酶活比例為1:1，25℃酶解3h；之后滅酶。
12、進一步，滅酶條件包括：沸水浴加熱20min。
13、本專利技術提供海參卵源肽復合物，海參卵源肽復合物采用上述方法制備。
14、進一步，所述海參卵源肽復合物包括wgn、wigg、gfpvg中的一種或幾種的組合。
15、進一步，本專利技術提供具有抗氧化和抑制酪氨酸酶雙活性的海參卵源活性肽，所述的海參卵源肽的氨基酸序列包括wgn、wigg、gfpvg中的一種或幾種。
16、優選地，海參卵源肽的氨基酸序列為wgn、wigg、gfpvg中的一種或幾種。
17、采取上述技術方案的有益效果包括：本專利技術提供的海參卵源活性肽可以提高海參副產物的附加值，減少資源的浪費并延長海參副產物的產業鏈。經實驗驗證，本專利技術篩選得到的wgn、wigg、gfpvg均能有效的清除dpph自由基、abts自由基以及抑制酪氨酸酶活性。海參卵源活性肽分子量均小于650kda，小分子肽易被人體消化吸收，作用于靶點。本專利技術提供的海參卵源活性肽均具有良好的溶解性并且對細胞均無毒性。
18、本專利技術提供上述海參卵源活性肽的制備方法，包括以下步驟：固相合成上述海參卵源肽。
19、本專利技術提供上述海參卵源活性肽的篩選方法，包括以下步驟：
20、(1)將海參卵采用堿性蛋白酶-胰蛋白酶混合酶解得到海參卵酶解液；
21、(2)將步驟(1)得到的海參卵酶解液經超濾、葡聚糖凝膠色譜、高效液相色譜進行三步分離，冷凍干燥，得到活性肽凍干粉；
【技術保護點】
1.海參卵源肽復合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：海參卵粉使用堿性蛋白酶-胰蛋白酶同步酶解。
2.根據權利要求1所述海參卵源肽復合物的制備方法，其特征在于，還包括將酶解后的產物超濾的步驟，將酶解產物依次經過分子量為10kDa和3kDa的超濾膜，收集分子量大于10kDa組分、3kDa-10kDa組分和小于3kDa的組分。
3.根據權利要求2所述海參卵源肽復合物的制備方法，其特征在于，還包括將小于3kDa的組分采用葡聚糖凝膠樹脂SephadexG-15分離的步驟，第25管至第50管合并到一起作為SCP-1組分、第58管至第77管合并到一起作為SCP-2組分，第85管至103管合并到一起作為SCP-3組分。
4.根據權利要求3所述海參卵源肽復合物的制備方法，其特征在于，還包括將SCP-2組分進行高效液相色譜分離，收集保留時間分別為2.099min、3.148min、4.833min、5.352min、13.533min、14.992min、20.99min的組分。
5.根據權利要求1-4任一項所述海參卵源肽復合物的制備方法，其特征
6.海參卵源肽復合物，其特征在于，采用權利要求1-5任一項所述方法制備。
7.海參卵源活性肽，其特征在于，海參卵源肽的氨基酸序列包括WGN、WIGG、GFPVG中的一種或幾種。
8.權利要求7所述海參卵源活性肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：固相合成權利要求7所述海參卵源肽。
9.權利要求7所述海參卵源活性肽的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：
10.權利要求6所述海參卵源肽復合物或權利要求7所述海參卵源活性肽在(1)至(3)任一項或任幾項中的應用；
...【技術特征摘要】
1.海參卵源肽復合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：海參卵粉使用堿性蛋白酶-胰蛋白酶同步酶解。
2.根據權利要求1所述海參卵源肽復合物的制備方法，其特征在于，還包括將酶解后的產物超濾的步驟，將酶解產物依次經過分子量為10kda和3kda的超濾膜，收集分子量大于10kda組分、3kda-10kda組分和小于3kda的組分。
3.根據權利要求2所述海參卵源肽復合物的制備方法，其特征在于，還包括將小于3kda的組分采用葡聚糖凝膠樹脂sephadexg-15分離的步驟，第25管至第50管合并到一起作為scp-1組分、第58管至第77管合并到一起作為scp-2組分，第85管至103管合并到一起作為scp-3組分。
4.根據權利要求3所述海參卵源肽復合物的制備方法，其特征在于，還包括將scp-2組分進行高效液相色譜分離，收集保留時間分別為2.099min、3.148min、4.833mi...
【專利技術屬性】
技術研發人員：崔方超，王當豐，任麗琨，張華威，勵建榮，李婷婷，李學鵬，王宗繼，張桂林，侯鵬，李英美，劉智騰，
申請(專利權)人：渤海大學，
類型：發明
國別省市：
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