【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于電化學(xué)傳感器，具體涉及一種微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法。
技術(shù)介紹
1、壞死性軟組織感染(necrotising?soft-tissue?infections,nstis)是一種嚴(yán)重的，以皮下組織、筋膜或肌肉壞死為特征的危及生命的細(xì)菌感染。nstis的死亡率高，20～50％的患者在早期死亡。因此，快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)和便攜的檢測(cè)方法對(duì)于幫助nstis患者的早期診斷和治療以及提高其生存率至關(guān)重要。
2、目前，對(duì)于壞死性軟組織感染的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要是臨床診斷，如核磁共振成像和ct等先進(jìn)的成像技術(shù)；基于傳統(tǒng)的血液樣本采集與分析是疾病相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，研究者還開發(fā)出一種壞死性筋膜炎實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)評(píng)分(lrinec)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)分析c反應(yīng)蛋白(crp)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(wbc)、血紅蛋白、鈉、肌酐和葡萄糖的含量，并對(duì)異常值進(jìn)行評(píng)分；現(xiàn)有檢測(cè)的取樣方法主要是靜脈采血。研究發(fā)現(xiàn)，血清crp的原始lrinec評(píng)分更能預(yù)測(cè)nstis，crp升高時(shí)應(yīng)高度懷疑患有nstis。健康狀況良好的成年人通常crp值低10mg/l，在炎癥期間crp濃度迅速升高，可達(dá)350～400mg/l。目前，nstis的治療依賴于抗生素和早期手術(shù)清創(chuàng)，萬(wàn)古霉素(va)用于治療由耐甲氧西林葡萄球菌敏感菌株引起的嚴(yán)重感染，包括皮膚和軟組織感染，以及青霉素過(guò)敏患者。因此，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)crp濃度的上升快速發(fā)現(xiàn)感染，并通過(guò)監(jiān)測(cè)va的濃度來(lái)提高nstis的治療效果。但是，當(dāng)前壞死性軟組織感染的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，如核磁共振成像和ct等先進(jìn)的成像技術(shù)，但消
3、因此，本領(lǐng)域亟需一種用于壞死性軟組織感染診療監(jiān)測(cè)的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、有疼痛感、設(shè)備復(fù)雜等問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于壞死性軟組織感染的檢測(cè)方法存在的檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、有疼痛感、設(shè)備復(fù)雜等問(wèn)題，提供一種微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，制備的微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器可用于壞死性軟組織感染的診療監(jiān)測(cè)，具有微創(chuàng)、小型化、便攜性、可連續(xù)監(jiān)測(cè)和數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)獲取等優(yōu)點(diǎn)。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：
3、一種微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，包括如下步驟：
4、(1)構(gòu)建基于中空微針的間質(zhì)液提取模塊；
5、所述間質(zhì)液提取模塊包括襯底和設(shè)在襯底上的中空微針陣列，所述襯底內(nèi)設(shè)有儲(chǔ)液室，所述中空微針具有空心腔體結(jié)構(gòu)，中空微針的底部與儲(chǔ)液室連通，所述襯底和中空微針陣列的材質(zhì)為光敏樹脂，通過(guò)光固化3d打印一體成型；
6、(2)采用恒電位法在雙通道絲網(wǎng)印刷電極(dspce)表面沉積花狀金納米結(jié)構(gòu)，得到dspce-au電極；
7、(3)將電化學(xué)信號(hào)分子標(biāo)記的萬(wàn)古霉素適體(va-apt)和c反應(yīng)蛋白適體(crp-apt)/輔助探針雜交雙鏈通過(guò)au-s鍵分別連接在dspce-au的工作電極a和工作電極b上，得到dspce-au電化學(xué)檢測(cè)模塊；
8、(4)將dspce-au電化學(xué)檢測(cè)模塊與間質(zhì)液提取模塊集成，得到微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器。
9、進(jìn)一步，步驟(1)中，所述中空微針陣列的微針針形為圓錐形，錐底直徑為600μm，針長(zhǎng)為1200μm，相鄰針尖距離為1200μm，每個(gè)微針上距離針尖200μm處均設(shè)有連通其空心腔體結(jié)構(gòu)的孔。
10、進(jìn)一步，步驟(1)中，所述光敏樹脂選自聚氨酯丙烯酸酯、環(huán)氧丙烯酸酯或聚酯丙烯酸酯中的一種。
11、進(jìn)一步，步驟(2)中，所述采用恒電位法在雙通道絲網(wǎng)印刷電極表面沉積花狀金納米結(jié)構(gòu)的方法為：將雙通道絲網(wǎng)印刷電極浸入聚丙烯酸(paa)和聚乙烯亞胺(pei)溶液中，在電極表面形成paa/pei薄膜，沖洗和干燥后，在雙通道絲網(wǎng)印刷電極的三電極區(qū)域上滴加20μl?50mm的haucl4，然后，通過(guò)電沉積獲得花狀金納米結(jié)構(gòu)。
12、進(jìn)一步，步驟(3)中，所述萬(wàn)古霉素適體的核苷酸序列為：
13、5’-cgagggtaccgcaatagtacttattgttcgcctattgtgggtcgg-3’(seq?id?no:1)；
14、輔助探針的核苷酸序列為：
15、5’-ttttttttcaccaaaacacgctttctcccctcttttccccttcg-3’(seq?id?no:2)；
16、c反應(yīng)蛋白適體的核苷酸序列為：
17、5’-cgaaggggattcgaggggtgattgcgtgctccatttggtg-mb-3’(seq?idno:3)。
18、進(jìn)一步，步驟(3)中，所述電化學(xué)信號(hào)分子為亞甲基藍(lán)。
19、進(jìn)一步，步驟(3)中，將電化學(xué)信號(hào)分子標(biāo)記的萬(wàn)古霉素適體和c反應(yīng)蛋白適體/輔助探針雜交雙鏈通過(guò)au-s鍵分別連接在dspce-au的工作電極a和工作電極b上的方法：用三(2-羧乙基)膦(tcep)活化萬(wàn)古霉素適體后，滴加在dspce-au的工作電極a表面，進(jìn)行室溫孵育，將c反應(yīng)蛋白適體和輔助探針同濃度等體積混合，用tcep活化0.5～3h，80～100℃退火5～60min后滴加在dspce-au的工作電極b表面，進(jìn)行室溫孵育。
20、采用上述方法制備得到的雙通道電化學(xué)適體傳感器。
21、上述方法制備的雙通道電化學(xué)適體傳感器在檢測(cè)壞死性軟組織感染標(biāo)志物萬(wàn)古霉素va和crp中的應(yīng)用。應(yīng)用方法：以檢測(cè)不含va和crp的電極基底信號(hào)為起點(diǎn)信號(hào)，然后采用微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器采集間質(zhì)液，使用方波伏安法檢測(cè)dspce-au傳感器的電化學(xué)信號(hào)并記為終點(diǎn)信號(hào)；
22、若終點(diǎn)信號(hào)與所述起點(diǎn)信號(hào)相比信號(hào)差異很小(低于5％)，則所述待測(cè)物中不存在被測(cè)靶標(biāo)va和crp；
23、若所述終點(diǎn)信號(hào)與所述起點(diǎn)信號(hào)相比信號(hào)上升或下降，則所述待測(cè)物中存在被測(cè)靶標(biāo)va或crp。
24、本專利技術(shù)有益效果：
25、1)本專利技術(shù)構(gòu)建采檢一體化的電化學(xué)微針poct傳感器件，具有微創(chuàng)、小型化、便攜性、可連續(xù)監(jiān)測(cè)和數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)獲取等優(yōu)點(diǎn)，突破傳統(tǒng)檢測(cè)儀器體積大、笨重以及無(wú)法即采即測(cè)的瓶頸。
26、2)本專利技術(shù)構(gòu)筑具備三維花狀金納米結(jié)構(gòu)的雙通道電化學(xué)適體傳感界面，具有抗生素藥物和感染標(biāo)志物協(xié)同檢測(cè)的功能，便于壞死性軟組織感染的動(dòng)態(tài)同步診療監(jiān)測(cè)。
27、3)本專利技術(shù)設(shè)計(jì)具有中空微腔結(jié)構(gòu)的微針作為流體樣本提取模塊，與采集血樣的采血針相比，發(fā)揮無(wú)痛、高效、連續(xù)提取間質(zhì)液的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)可以降低二次感染風(fēng)險(xiǎn)。
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1.一種微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述中空微針陣列的微針針形為圓錐形，錐底直徑為600μm，針長(zhǎng)為1200μm，相鄰針尖距離為1200μm，每個(gè)微針上距離針尖200μm處均設(shè)有連通其空心腔體結(jié)構(gòu)的孔。
3.如權(quán)利要求1所述微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述光敏樹脂選自聚氨酯丙烯酸酯、環(huán)氧丙烯酸酯或聚酯丙烯酸酯中的一種。
4.如權(quán)利要求1所述微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述采用恒電位法在雙通道絲網(wǎng)印刷電極表面沉積花狀金納米結(jié)構(gòu)的方法為：將雙通道絲網(wǎng)印刷電極浸入PAA和PEI溶液中，在電極表面形成PAA/PEI薄膜，沖洗和干燥后，在雙通道絲網(wǎng)印刷電極的三電極區(qū)域上滴加20μL?50mM的HAuCl4，然后，通過(guò)電沉積獲得花狀金納米結(jié)構(gòu)。
5.如權(quán)利要求1所述微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(3)
6.如權(quán)利要求1所述微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述電化學(xué)信號(hào)分子為亞甲基藍(lán)。
7.如權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，將電化學(xué)信號(hào)分子標(biāo)記的萬(wàn)古霉素適體和C反應(yīng)蛋白適體/輔助探針雜交雙鏈通過(guò)Au-S鍵分別連接在DSPCE-Au的工作電極A和工作電極B上的方法為：用三(2-羧乙基)膦活化萬(wàn)古霉素適體后，滴加在DSPCE-Au的工作電極A表面，進(jìn)行室溫孵育，將C反應(yīng)蛋白適體和輔助探針同濃度等體積混合，用三(2-羧乙基)膦活化0.5～3h，80～100℃退火5～60min后滴加在DSPCE-Au的工作電極B表面，進(jìn)行室溫孵育。
8.采用權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述方法制備得到的雙通道電化學(xué)適體傳感器。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述中空微針陣列的微針針形為圓錐形，錐底直徑為600μm，針長(zhǎng)為1200μm，相鄰針尖距離為1200μm，每個(gè)微針上距離針尖200μm處均設(shè)有連通其空心腔體結(jié)構(gòu)的孔。
3.如權(quán)利要求1所述微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述光敏樹脂選自聚氨酯丙烯酸酯、環(huán)氧丙烯酸酯或聚酯丙烯酸酯中的一種。
4.如權(quán)利要求1所述微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述采用恒電位法在雙通道絲網(wǎng)印刷電極表面沉積花狀金納米結(jié)構(gòu)的方法為：將雙通道絲網(wǎng)印刷電極浸入paa和pei溶液中，在電極表面形成paa/pei薄膜，沖洗和干燥后，在雙通道絲網(wǎng)印刷電極的三電極區(qū)域上滴加20μl?50mm的haucl4，然后，通過(guò)電沉積獲得花狀金納米結(jié)構(gòu)。
5.如權(quán)利要求1所述微針介導(dǎo)的雙通道電化學(xué)適體傳...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：苑仁強(qiáng)，蔡靜，蘇邵，汪聯(lián)輝，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京郵電大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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