【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體特別是高通量檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體的質(zhì)粒組合、假病毒和假病毒組合。本專利技術(shù)還涉及一種制備假病毒的方法，以及一種用于高通量檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體的方法。
技術(shù)介紹
1、脊髓灰質(zhì)炎(poliomyelitis，polio，簡(jiǎn)稱脊灰)主要是由脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus，pv，簡(jiǎn)稱為脊灰病毒)引起的急性腸道傳染病，主要影響五歲以下兒童。脊灰病毒主要經(jīng)糞-口傳播，侵入人體后主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致不可逆的肢體癱瘓，俗稱“小兒麻痹癥”。
2、該病毒屬于小rna病毒科，腸道病毒屬。病毒直徑為20-30nm，內(nèi)含單股正鏈的核糖核酸，無(wú)包膜。脊灰病毒的rna基因組長(zhǎng)度大約是7500nt，主要分為5’端非編碼區(qū)、多聚蛋白編碼區(qū)和3’端非編碼區(qū)三部分。多聚蛋白編碼區(qū)，可分為p1、p2和p3三部分。p1區(qū)為結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，編碼的結(jié)構(gòu)蛋白p1是構(gòu)成病毒衣殼的前體蛋白，可被病毒蛋白酶加工成vp0、vp3和vp1，其中vp1是引發(fā)中和反應(yīng)最重要的抗原決定簇，是病毒免疫反應(yīng)中的最主要抗原。p2和p3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，調(diào)控蛋白水解加工和復(fù)制。
3、脊灰病毒按抗原性不同，可分為三種血清型(1型、2型和3型)，型間無(wú)交叉免疫。常見(jiàn)的毒株包括：減毒株(sabin1型、sabin2型和sabin3型)、野生毒株(1型mahoney、2型mef-1、3型saukett)、疫苗相關(guān)病毒(vapv)以及疫苗衍生脊灰病毒(vdpv)。脊灰病毒同一個(gè)血清型的不同病毒
4、脊灰病毒中和抗體的檢測(cè)對(duì)于評(píng)估脊灰疫苗接種效果、診斷脊灰病毒感染、監(jiān)測(cè)脊灰病毒傳播以及制定公共衛(wèi)生策略具有重要意義。傳統(tǒng)的脊灰病毒中和抗體檢測(cè)方法主要依賴于傳染性活病毒[1]，該方法存在操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、通量低、生物安全要求高(需在指定的bsl-3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行)等局限性。此外，隨著全球消滅脊灰進(jìn)程的加快和脊灰病毒封存計(jì)劃的開(kāi)展，迫切需要開(kāi)發(fā)出一種替代活病毒的高通量的中和抗體檢測(cè)方法。
5、基于脊灰假病毒的中和抗體檢測(cè)是替代傳統(tǒng)中和試驗(yàn)的有效方法[2-7]，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，具有安全性高(在bsl-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行)、簡(jiǎn)便快速、客觀定量的顯著優(yōu)點(diǎn)。目前已有的脊灰假病毒中和檢測(cè)方法使用的是rd細(xì)胞系和攜帶化學(xué)報(bào)告基因(如螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因，luciferase)的假病毒，一次試驗(yàn)只能檢測(cè)一種型別的中和抗體，通量相對(duì)較低[2-7]。此外，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)步驟相對(duì)繁瑣，且需要加入價(jià)格昂貴的外源底物。
6、因此，需要開(kāi)發(fā)一種基于熒光假病毒的可同時(shí)檢測(cè)三種型別脊灰病毒中和抗體的檢測(cè)方法，該方法兼具檢測(cè)通量高、自動(dòng)化檢測(cè)、節(jié)省樣本、經(jīng)濟(jì)便捷等優(yōu)點(diǎn)，為大規(guī)模人群脊灰病毒中和抗體的監(jiān)測(cè)、脊灰疫苗的效力評(píng)價(jià)等提供了技術(shù)支撐。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)人經(jīng)過(guò)深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，利用脊灰病毒衣殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒、攜帶熒光報(bào)告基因的復(fù)制子質(zhì)粒和t7-rna聚合酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hek?293t細(xì)胞制備脊灰熒光假病毒。通過(guò)優(yōu)化熒光報(bào)告基因的選擇、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例和敏感細(xì)胞系等，制備了高滴度的三種型別分別攜帶不同熒光報(bào)告基因e2-crimson(簡(jiǎn)稱為e2)、egfp和dsred-express(簡(jiǎn)稱為rfp)的脊灰假病毒。通過(guò)對(duì)中和檢測(cè)的敏感細(xì)胞加入量、病毒加入量、檢測(cè)時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化開(kāi)發(fā)，三種型別的脊灰熒光假病毒與hek?293t細(xì)胞建立了脊灰中和抗體的高通量檢測(cè)方法。由此提供了下述專利技術(shù)：
2、本專利技術(shù)的一個(gè)方面涉及一種質(zhì)粒組合，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒、脊髓灰質(zhì)炎病毒復(fù)制子質(zhì)粒和rna聚合酶表達(dá)質(zhì)粒，其中：
3、所述脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒為脊髓灰質(zhì)炎病毒p1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒；
4、所述脊髓灰質(zhì)炎病毒復(fù)制子質(zhì)粒依次包括：?jiǎn)?dòng)子、5’utr、熒光報(bào)告基因、2a肽位點(diǎn)、脊髓灰質(zhì)炎病毒的p2基因、脊髓灰質(zhì)炎病毒的p3基因、3’utr和poly?a，并且不包括脊髓灰質(zhì)炎病毒p1基因。
5、不拘于理論的限制，由于將脊灰病毒完整的基因組序列中的p1基因替換為熒光報(bào)告基因，缺少了p1基因，使得脊灰假病毒的基因組是缺陷型基因組，脊灰假病毒只能單輪復(fù)制，安全性更高。
6、不拘于理論的限制，p2、p3是功能性蛋白，具有蛋白酶切作用并且對(duì)病毒組裝相關(guān)功能有影響。
7、不拘于理論的限制，2a肽位點(diǎn)(例如2apro位點(diǎn))是脊灰病毒的酶切位點(diǎn)，具有自切割功能，能夠避免或者減少熒光報(bào)告基因?qū)2、p3的成熟和/或?qū)Σ《绢w粒的組裝產(chǎn)生影響。
8、不拘于理論的限制，聚合酶表達(dá)質(zhì)粒的作用主要是結(jié)合脊髓灰質(zhì)炎病毒復(fù)制子質(zhì)粒上的啟動(dòng)子，保證脊髓灰質(zhì)炎病毒復(fù)制子質(zhì)粒的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯。
9、在本專利技術(shù)的一些實(shí)施方式中，所述的質(zhì)粒組合，其特征在于如下的(1)至(15)項(xiàng)中的任意一項(xiàng)或者任意多項(xiàng)(例如任意2項(xiàng)、任意3項(xiàng)、任意4項(xiàng)、任意5項(xiàng)、任意6項(xiàng)、任意7項(xiàng)、任意8項(xiàng)、任意9項(xiàng)、任意9項(xiàng)、任意10項(xiàng)、任意11項(xiàng)、任意12項(xiàng)、任意13項(xiàng)、任意14項(xiàng)或者全部15項(xiàng))：
10、(1)所述真核表達(dá)質(zhì)粒獨(dú)立地為pcdna3.1、pcdna3.2、pcdna3.3或pcdna3.4；
11、(2)所述啟動(dòng)子為t7啟動(dòng)子并且所述rna聚合酶為t7?rna聚合酶，
12、所述啟動(dòng)子為t3啟動(dòng)子并且所述rna聚合酶為t3聚合酶，或者，
13、所述啟動(dòng)子為sp6啟動(dòng)子并且所述rna聚合酶為sp6聚合酶；
14、(3)所述熒光報(bào)告基因?yàn)檫x自egfp、zsgreen、ypet、rfp、morange、dtomato、mcherry、mkate2和e2中的一種或多種；
15、(4)所述2a肽為選自2apro、p2a、t2a、e2a和f2a中的一種或多種；
16、(5)所述5’utr來(lái)自脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組；
17、(6)所述3’utr來(lái)自脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組；
18、(7)所述5’utr包含seq?id?n本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種質(zhì)粒組合，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒、脊髓灰質(zhì)炎病毒復(fù)制子質(zhì)粒和RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒，其中：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒組合，其特征在于如下的(1)至(15)項(xiàng)中的任意一項(xiàng)或者任意多項(xiàng)：
3.一種質(zhì)粒產(chǎn)品，包括第一質(zhì)粒組合、第二質(zhì)粒組合和第三質(zhì)粒組合，并且所述第一質(zhì)粒組合、第二質(zhì)粒組合和第三質(zhì)粒組合為權(quán)利要求1至2中任一權(quán)利要求所述的質(zhì)粒組合，其中：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒產(chǎn)品，其中，所述熒光報(bào)告基因選自eGFP、RFP和E2；
5.一種制備脊髓灰質(zhì)炎假病毒的方法，包括將權(quán)利要求1至2中任一權(quán)利要求所述的質(zhì)粒組合或者權(quán)利要求3至4中任一權(quán)利要求所述的質(zhì)粒產(chǎn)品轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的步驟；
6.一種脊髓灰質(zhì)炎假病毒，其由權(quán)利要求5所述的方法制得；
7.一種脊髓灰質(zhì)炎假病毒組合，包括1型脊髓灰質(zhì)炎假病毒、2型脊髓灰質(zhì)炎假病毒和3型脊髓灰質(zhì)炎假病毒，分別由權(quán)利要求3至4中任一權(quán)利要求所述的質(zhì)粒產(chǎn)品中的第一質(zhì)粒組合、第二質(zhì)粒組合和第三質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞制得，
8.一種非治療目的且非診斷目的
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于如下的①至⑨項(xiàng)中的任意一項(xiàng)或者任意多項(xiàng)：
10.權(quán)利要求6所述的脊髓灰質(zhì)炎假病毒或者權(quán)利要求7所述的脊髓灰質(zhì)炎假病毒組合在制備檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體、評(píng)估脊髓灰質(zhì)炎疫苗接種效果、診斷脊髓灰質(zhì)炎病毒感染或者監(jiān)測(cè)脊灰病毒傳播的藥物中的用途。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種質(zhì)粒組合，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒、脊髓灰質(zhì)炎病毒復(fù)制子質(zhì)粒和rna聚合酶表達(dá)質(zhì)粒，其中：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒組合，其特征在于如下的(1)至(15)項(xiàng)中的任意一項(xiàng)或者任意多項(xiàng)：
3.一種質(zhì)粒產(chǎn)品，包括第一質(zhì)粒組合、第二質(zhì)粒組合和第三質(zhì)粒組合，并且所述第一質(zhì)粒組合、第二質(zhì)粒組合和第三質(zhì)粒組合為權(quán)利要求1至2中任一權(quán)利要求所述的質(zhì)粒組合，其中：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒產(chǎn)品，其中，所述熒光報(bào)告基因選自egfp、rfp和e2；
5.一種制備脊髓灰質(zhì)炎假病毒的方法，包括將權(quán)利要求1至2中任一權(quán)利要求所述的質(zhì)粒組合或者權(quán)利要求3至4中任一權(quán)利要求所述的質(zhì)粒產(chǎn)品轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的步驟；
6.一...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王佑春，于原玲，劉美巖，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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