【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于但不限于分子生物學，尤其涉及一種香葉醇合成酶基因的克隆方法及其應用。
技術介紹
1、香葉醇(geraniol)，又稱牻牛兒醇，是一種天然存在的單萜類不飽和醇，廣泛分布于玫瑰(rosa?damascena)、天竺葵(pelargonium?graveolens)、香茅(cymbopogon?spp.)等多種植物的精油中。作為一種無環單萜醇，香葉醇具有獨特的甜潤花香，是調配玫瑰、柑橘及薰衣草香型的關鍵成分，已廣泛應用于高端香水、護膚品及眾多香料中。現代醫學研究表明，香葉醇具有豐富的藥理活性，涵蓋抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、器官保護及代謝調節等多重功能。作為萜烯家族的重要成員，香葉醇在香料、醫藥、農業及食品工業中展現出顯著的應用價值。隨著天然產物開發需求的不斷增長，香葉醇作為合成香料替代品及多功能生物活性分子的潛力備受關注，近年來已成為天然產物開發與綠色生物技術研究的熱點。雖然目前香葉醇可通過從植物中直接分離提取，以及化學合成等的方法獲得，但由于香葉醇在植物中的含量極低，提取分離存在提取效率低下的問題，而化學合成的方法面臨副產物復雜和雙鍵易氧化等多重挑戰。因此，利用合成生物學的手段，通過微生物細胞工廠進行制備，成為解決這一高價值成分生產問題的有效途徑。
2、南蛇藤(celastrus?orbiculatus)是衛矛科南蛇藤屬植物，作為一種藥用價值廣泛的中藥，在我國有著悠久的用藥歷史，具有解毒消腫、祛風除濕、通經止痛、活血散瘀、安神、消炎、強筋骨等功效。現代藥理研究表明，南蛇藤具有抗腫瘤、抗多重耐藥、抗動脈硬化
3、鑒于上述分析，現有技術存在的急需解決的技術問題為：目前缺少在南蛇藤中有單萜合成酶的研究。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的問題，本專利技術提供了
2、本專利技術是這樣實現的，一種香葉醇合成酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表seq?id?no.1所示；基因編碼蛋白質的氨基酸殘基序列如序列表seq?id?no.2所示；
3、本專利技術的另一目的在于提供一種克隆所屬香葉醇合成酶基因cotps1的方法，具體操作步驟如下：
4、(1)提取南蛇藤總rna并反轉錄成cdna；
5、(2)以cdna為模板，設計特異性引物，通過pcr擴增香葉醇合成酶基因cotps1；
6、(3)通過瓊脂糖凝膠電泳和瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒對步驟(2)中的pcr產物回收并純化，即得所述香葉醇合成酶基因cotps1片段。
7、進一步，采用2x?phanta?max?master?mix(p515-03，南京諾唯贊生物科技股份有限公司)高保真dna聚合酶進行pcr擴增。
8、進一步，pcr擴增體系為2x?phanta?max?master?mix?10μl，正反向引物各0.5μl，ddh2o?8μl，模板1μl，總反應體系20μl。
9、pcr擴增反應條件為：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃1min，32循環；72℃5min。
10、本專利技術的另一目的在于提供一種所述香葉醇合成酶基因cotps1的應用方法，構建一種合成香葉醇的工程菌，所述菌株以釀酒酵母為出發菌株，過表達thmgr、upc2-1、erg20f96w-n127w和cotps1；其中：
11、(1)thmgr和upc2-1基因整合到釀酒酵母染色體ty3位點；
12、(2)erg20f96w-n127w整合到rox1位點；
13、(3)cotps1基因整合到釀酒酵母染色體的ty2位點；
14、進一步，所述的釀酒酵母為釀酒酵母by4741。
15、進一步，合成香葉醇的釀酒酵母工程菌株的構建方法包括如下步驟：
16、(1)利用重疊pcr構建以下模塊：
17、(a)將gal1p、thmgr和adh1t連接，構建基因表達模塊gal1p-thmgr-adh1t，命名為模塊i；
18、(b)將gal10p、upc2-1和cyc1t連接，構建基因表達模塊gal10p-upc2-1-cyc1t，命名為模塊ii；
19、(c)將模塊ii和模塊iii連接，構建基因表達模塊gal1p-thmgr-adh1t-gal10p-upc2-1-cyc1t，命名為模塊iii；
20、(d)將gal10p、erg20f96w-n127w和cyc1t連接，構建基因表達模塊gal10p-erg20f96w-n127w-cyc1t，命名為模塊iv；
21、(e)模板iv和his篩選標記連接，構建基因表達模塊his-v，命名為模塊v；
22、(f)將gal1p、cotps1和adh1t連接，構建基因表達模塊gal1p-cotps1-adh1t，命名為模塊vi；
23、(2)構建菌株xy01
24、將模塊iii插入到載體pcfb2875的sfasi酶切位點，得到整合表達載體pcfb2875-iii；然后用限制性核酸內切酶notι酶切整合表達載體pcfb2875-iii，得到dna整合片段s1；再將dna整合片段s1整合到酵母工程菌染色體的ty3位點，得到菌株xy01；
25、(3)構建菌株xy02
26、將psh65載體轉化菌株xy01，并進行篩選，得到菌株xy02；
27、(4)構建菌株xy03
28、將模塊v轉化酵母工程菌xy02，得到菌株xy03；
29、(5)構建菌株xy04
30、將模塊vi插入到載體pcfb2797的sfasi酶切位點，得到整合表達載體pcfb2797-vi；將模塊ix插入到載體pcfb2797-vi的nhei酶切位點，得到整合表達載體pcfb2797-vi-ix；然后用限制性核酸內切酶notι酶切整合表達載體pcfb2797-vi-ix，得到dna整合片段s2；再將dna整合片段s2整合到菌株tx04染色體的ty2位點，得到菌株xy04，得到所述高產檀香醇的釀酒酵母工程菌；
31、進一步，步驟(1)中所述的thmgr、upc2-1和erg20f96w-n127w基因可從釀酒酵母by4741基因組克隆得到，其核苷酸序列如seq?id?no.3～5所示。
32、步驟(1)所述的gal1p、gal10p為啟動子序列，可從釀酒酵母by4741基因組克隆得到，其核苷酸序列分別為seq?id?no.7～8所示。
33、步驟(1)中所述的adh1本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種香葉醇合成酶基因CoTPS1，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示；基因編碼蛋白質的氨基酸殘基序列如序列表SEQ?ID?NO.2所示。
2.一種克隆如權利要求1所述香葉醇合成酶基因CoTPS1的方法，其特征在于，具體操作步驟如下：
3.如權利要求2所述的克隆香葉醇合成酶基因CoTPS1的方法，其特征在于，采用2xPhanta?Max?Master?Mix高保真DNA聚合酶進行PCR擴增。
4.如權利要求2所述的克隆香葉醇合成酶基因CoTPS1的方法，其特征在于，PCR擴增體系為2x?Phanta?Max?Master?Mix?10μL，正反向引物各0.5μL，ddH2O8μl，模板1μL，總反應體系20μL；
5.一種如權利要求1所述香葉醇合成酶基因CoTPS1的應用方法，其特征在于，構建一種合成香葉醇的工程菌，所述菌株以釀酒酵母為出發菌株，過表達tHMGR、UPC2-1、Erg20F96W-N127W和CoTPS1；其中：
6.如權利要求5所述的香葉醇合成酶基因CoTPS1的應用方法，所述
7.如權利要求5所述的香葉醇合成酶基因CoTPS1的應用方法，合成香葉醇的釀酒酵母工程菌株的構建方法包括如下步驟：
8.如權利要求5所述的香葉醇合成酶基因CoTPS1的應用方法，步驟(1)中所述的tHMGR、UPC2-1和Erg20F96W-N127W基因可從釀酒酵母BY4741基因組克隆得到，其核苷酸序列如SEQ?IDNO.3～5所示；
9.如權利要求5所述的香葉醇合成酶基因CoTPS1的應用方法，將合成香葉醇的釀酒酵母工程菌經活化后接種到發酵培養基中進行發酵培養，得到香葉醇。
10.一種如權利要求1所述香葉醇合成酶基因CoTPS1在香葉醇及其他以香葉醇為底物的萜類化合物的的釀酒酵母工程菌構建中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種香葉醇合成酶基因cotps1，其特征在于，其核苷酸序列如序列表seq?id?no.1所示；基因編碼蛋白質的氨基酸殘基序列如序列表seq?id?no.2所示。
2.一種克隆如權利要求1所述香葉醇合成酶基因cotps1的方法，其特征在于，具體操作步驟如下：
3.如權利要求2所述的克隆香葉醇合成酶基因cotps1的方法，其特征在于，采用2xphanta?max?master?mix高保真dna聚合酶進行pcr擴增。
4.如權利要求2所述的克隆香葉醇合成酶基因cotps1的方法，其特征在于，pcr擴增體系為2x?phanta?max?master?mix?10μl，正反向引物各0.5μl，ddh2o8μl，模板1μl，總反應體系20μl；
5.一種如權利要求1所述香葉醇合成酶基因cotps1的應用方法，其特征在于，構建一種合成香葉醇的工程菌，所述菌株以釀酒酵母為出發菌株，過表達thmgr...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王峻，安天悅，于同樂，王國麗，范本貴，梁希芹，
申請(專利權)人：濱州醫學院，
類型：發明
國別省市：
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